呂 波，賈桂穎

(天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072)

藥物經(jīng)給藥部位吸收入血，在人體內(nèi)通過與蛋白迅速可逆的結(jié)合，從而影響到藥物作用的產(chǎn)生、發(fā)展和消除。研究藥物與蛋白結(jié)合機(jī)理、結(jié)合常數(shù)、部位、作用力等不僅對藥物代謝動力學(xué)，臨床用藥有一定意義，且對藥物分子設(shè)計(jì)、新藥研發(fā)也有重要指導(dǎo)意義。藥物蛋白結(jié)合常數(shù)(Ka)是評價藥物性質(zhì)的重要參數(shù)，簡單快速的測定Ka值，對于藥物蛋白相互作用研究，藥物評價與篩選具有重要意義。

Ka常見的測定方法有平衡透析法［1］、熒光光譜法［2］、親和色譜法［3］、核磁共振分析法［4］等。這些方法都存在一定缺陷，如透析法測定周期長，且往往是單點(diǎn)測量，測量誤差大;熒光法中蛋白不可重復(fù)利用，不利于一些昂貴的蛋白研究;親和色譜法需要制備特殊的鍵合蛋白的色譜填料并進(jìn)行裝柱;核磁共振分析法雖獲得信息量大，但是測定周期長，儀器昂貴，且不利于定量分析，對蛋白純度要求也極高。磁性微球曾被用于藥物蛋白結(jié)合常數(shù)測定［5-6］，最近王秋玲等［7］將磁性微球應(yīng)用于凝血酶蛋白-抑制劑解離常數(shù)的快速測定，但磁性材料其特殊性質(zhì)(如含有Fe3+)容易造成非特異性吸附高、蛋白失活、測量誤差大等結(jié)果。

瑞替加濱是首個開發(fā)的鉀離子通道開放劑，用于成人癲癇部分發(fā)作的輔助治療，在血藥濃度0.1～2μg/mL范圍內(nèi)，本品約80%與血漿蛋白結(jié)合［8］，但是其結(jié)合常數(shù)還未見報(bào)道。本文以非磁性微球?yàn)檩d體，以BSA為蛋白模型，通過篩選微球、優(yōu)化蛋白偶聯(lián)方法，降低了微球?qū)λ幬锏姆翘禺愋晕剑ㄟ^一步步探究將可能引起誤差原因降至最低。最終采用一種氨基化微球用于Retigabine與BSA的結(jié)合常數(shù)測定，并與傳統(tǒng)熒光光譜法測定結(jié)果進(jìn)行對比。新方法測定準(zhǔn)確、精密度高、方法簡易、成本低、且蛋白可重復(fù)利用，對研究藥物蛋白相互作用提供了新方法、新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

瑞替加濱原料藥(純度 ＞99.5%)，自制;牛血清白蛋白，生物級;BCA蛋白濃度測定試劑盒;無定形氨基硅膠(氨基279.16 μmol/g，40 ～60 μm);球形氨基硅膠(氨基303.28 μmol/g，5 μm);氨基聚苯乙烯微球(氨基102.36 μmol/g，5 μm);羧基聚苯乙烯微球(羧基 256.96 μmol/g，5 μm);1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，純度97%);N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，純度98%);戊二醛、氰基硼氫化鈉、甲醇均為分析純。

Waters高效液相色譜儀(包括Waters 510高壓輸液泵，Waters 486紫外檢測器和N2000在線色譜工作站);C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);970CRT熒光分光光度計(jì);SHZ-82恒溫振蕩器。

1.2 牛血清白蛋白偶聯(lián)微球的制備

1.2.1 EDC/NHS法 取50 mg氨基微球均勻分散于1 mL PBS緩沖液中。加入9 mg BSA，渦旋分散均勻，加入12.5 mg NHS，緩慢振搖后加入25 mg EDC，室溫振蕩反應(yīng)2 h，用緩沖液充分洗滌，即得。

1.2.2 戊二醛交聯(lián)法 取50 mg氨基微球均勻分散于 1 mL PBS 緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)中，加入3 mL戊二醛水溶液(0.529 mol/L)，27℃活化反應(yīng)2 h。用PBS離心洗滌3次，加入2 mL BSA溶液(10 mg/mL)，37℃恒溫振蕩反應(yīng)19 h。加入50 mg氰基硼氫化鈉繼續(xù)反應(yīng)4 h。用緩沖液充分洗滌，得蛋白偶聯(lián)微球。

1.3 蛋白偶聯(lián)微球應(yīng)用于瑞替加濱與BSA結(jié)合研究

1 mL的EP管中加入300μL瑞替加濱溶液(0.75μmol/L)，設(shè)置自由組、空白組和實(shí)驗(yàn)組，對應(yīng)的再分別加入500μL的PBS緩沖液、空白微球PBS溶液(12.5 mg/mL)、鍵合蛋白微球PBS溶液(12.5 mg/mL)，混合均勻后37℃恒溫振蕩15 min，經(jīng)離心分離，用高效液相色譜法分別測定三組上清液中瑞替加濱藥物濃度。改變藥物濃度，重新測定，最后相應(yīng)數(shù)值代入Rosenthal方程［9］，計(jì)算得到瑞替加濱與BSA的結(jié)合常數(shù)。

1.4 分析方法

1.4.1 微球鍵合蛋白量測定 采用BCA蛋白濃度測定法。取20μL球液(50 mg/mL)與200μL工作液混合，60℃孵育30 min，13 000 r/min離心3 min。取100μL上清液，用酶標(biāo)儀測定562 nm波長條件下吸光度值。同法在0～45.45 mg/L濃度范圍內(nèi)建立BSA標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線。對比標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得微球鍵合蛋白量。

1.4.2 高效液相色譜法測定上清液中瑞替加濱藥物濃度條件 流動相甲醇∶磷酸緩沖液(0.03%，v/v，pH 2.6)，比例為 70∶30(v/v)，流速 0.7 mL/min，紫外檢測波長252 nm，進(jìn)樣體積20μL。

1.4.3 熒光分光光度法測定瑞替加濱與BSA結(jié)合常數(shù) 激發(fā)波長為285 nm，在200～800 nm范圍內(nèi)掃描發(fā)射波長，靈敏度4，入射狹縫 10 nm，出射狹縫10 nm。

5 mL熒光比色皿中加入2.5 mL BSA溶液(1.0×10－5moL/L)，連續(xù)掃描3次，加入10μL瑞替加濱溶液(1.48μmoL/L)，反復(fù)吹打混合均勻后，連續(xù)掃描3次。再次重復(fù)加入藥物溶液，重復(fù)上述步驟。加入藥液總量不超過100μL，記錄保存圖譜，取374 nm波長條件下熒光強(qiáng)度作為計(jì)算值代入Stern-Volmer方程［10］，計(jì)算得瑞替加濱與BSA的結(jié)合常數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同粒子對瑞替加濱的非特異性吸附研究

空白微球會與瑞替加濱產(chǎn)生非特異性吸附，為了盡可能的降低非特異性吸附，減少誤差，對幾種常見的非磁性粒子——無定形氨基硅膠、球形氨基硅膠(SiO2-NH2)、氨基聚苯乙烯微球(PS-NH2)、羧基聚苯乙烯微球(PS-COOH)的非特異性吸附進(jìn)行考察，結(jié)果見圖1。

圖1 不同粒子對瑞替加濱的非特異性吸附研究Fig.1 The study of nonspecific adsorption for different particles to Retigabine

由圖1可知，在同一藥物初始濃度(5μmol/L)下，加入相同量(6.25 mg)的空白粒子，4種粒子的非特異性吸附分別占藥物初始濃度的0.33%，3.96%，8.26%，27.57%。無定形氨基硅膠對瑞替加濱幾乎沒有吸附，這與其表面親水，孔徑較大有關(guān)，但是無定形硅膠與蛋白鍵合量很低，親水性強(qiáng)，后續(xù)離心操作中很容易丟失，不宜作為蛋白載體。SiO2-NH2與PS-NH2吸附量接近，PS-NH2吸附量更高，這主要是因其表面親脂。經(jīng)二步溶脹的羧基化聚苯乙烯微球空白吸附量最高，原因一是其表面親脂，二是表面為疏松多孔結(jié)構(gòu)，三在pH 7.4的PBS緩沖液條件下，其表面羧基官能團(tuán)(pKa4.74)易與堿性藥物瑞替加濱(pKa10.8)靜電結(jié)合。綜上初步確定球形氨基硅球(SiO2-NH2)與氨基化聚苯乙烯微球(PS-NH2)為測定結(jié)合常數(shù)所用微球。

2.2 EDC/NHS法與戊二醛交聯(lián)法對蛋白鍵合量影響

考察了EDC/NHS法中蛋白濃度對蛋白偶聯(lián)量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 EDC/NHS法中BSA濃度對蛋白鍵合量影響Fig.2 Effect of BSA concentration on the protein binding content for EDC/NHSmethod

由圖2可知，隨BSA濃度增加，蛋白鍵合量出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，PS-NH2(表面氨基量102.36 μmoL/g)最高鍵合量為 2.88 mg/g。初始鍵合量增加，是因?yàn)镋DC/NHS相對過量，BSA中羧基官能團(tuán)與微球上的氨基鍵合。蛋白濃度進(jìn)一步升高，EDC/NHS不足以使過量的蛋白鍵合到微球表面，相反會引起B(yǎng)SA蛋白間的相互反應(yīng)，所以鍵合量下降。經(jīng)計(jì)算該方法的蛋白利用率僅為1.6%，表面氨基利用率為0.42‰。

戊二醛法中戊二醛濃度與蛋白濃度對蛋白偶聯(lián)量影響結(jié)果見圖3和圖4。

由圖3(蛋白濃度2 g/L)可知，隨戊二醛濃度增大，蛋白鍵合量增加，且低濃度范圍內(nèi)，鍵合量增加顯著。戊二醛濃度為0.529 moL/L(與微球表面氨基反應(yīng)比例為4.1∶10)時，蛋白鍵合量最高。繼續(xù)增大戊二醛濃度，容易使蛋白失活，且戊二醛分子兩端醛基會同時與微球表面氨基反應(yīng)，無法起到橋接作用，不利于蛋白鍵合。

圖3 戊二醛濃度對蛋白鍵合量影響Fig.3 Effect of glutaraldehyde concentration on the protein binding content

圖4 BSA濃度對蛋白鍵合量影響Fig.4 Effect of BSA concentration on the protein binding content

由圖4(戊二醛濃度0.529 moL/L)可知，蛋白濃度在0.3～25 g/L范圍內(nèi)變動，蛋白鍵合量增勢逐漸趨于平緩。這是因?yàn)槲於┗罨被鶖?shù)量有限，過高濃度蛋白也無法鍵合到微球表面。BSA濃度為10 g/L時，PS-NH2蛋白鍵合量為12.44 mg/g，SiO2-NH2可達(dá) 39.86 mg/g，均比 EDC/NHS 法高出數(shù)倍，因此，選用戊二醛法作為蛋白偶聯(lián)方法。SiO2-NH2微球有最高的蛋白鍵合量，確定選用SiO2-NH2微球?yàn)檩d體。

2.3 藥物蛋白相互作用結(jié)合時間考察

在瑞替加濱濃度為5μmoL/L條件下，加入6.25 mg SiO2-NH2-BSA 微球，測定2～30 min條件下藥物吸附量，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，起始階段，瑞替加濱與蛋白結(jié)合急劇增加，從2 min開始，吸附逐漸變緩，后達(dá)到飽和，10 min時吸附量已不再增加。為使瑞替加濱與蛋白充分結(jié)合，同時考慮到測量時間與藥物穩(wěn)定性，將結(jié)合時間定為15 min。

圖5 結(jié)合時間對藥物吸附量影響Fig.5 Effect of bonding time on the quantity of drug adsorption

2.4 藥物濃度對結(jié)合常數(shù)的影響

鍵合蛋白微球用量6.25 mg，測定吸附前后上清藥物濃度變化，繪制等溫吸附曲線，見圖6。

由圖6可知，瑞替加濱吸附量隨藥物濃度增大而增大，低濃度范圍內(nèi)增大較快，后逐漸平緩，達(dá)到飽和吸附。選取測量濃度應(yīng)注意，一藥物濃度不宜過高，否則藥物相對蛋白過量，易造成吸附不完全，引起誤差。二藥物濃度不宜過低，否則達(dá)到紫外檢測器極限，引起偶然誤差。三為模擬人體環(huán)境，藥物濃度應(yīng)盡量與血藥濃度接近，即在微摩爾每升濃度范圍內(nèi)。最終確定選取1.25～15μmol/L濃度范圍為測定范圍。

2.5 結(jié)合常數(shù)測定

在1.25～15μmol/L范圍內(nèi)改變?nèi)鹛婕訛I藥物濃度，通過HPLC-UV方法測定上清濃度變化，結(jié)果見圖7(藥物初始濃度為7.5μmol/L)，將相應(yīng)數(shù)值代入Rosenthal方程:

式中 ［Db］——藥物與蛋白凈結(jié)合濃度，mol/L;

［D'］——藥物與微球非特異性吸附濃度，mol/L;

Bmax——固定化蛋白活性結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，mol/L;

Kd——藥物與蛋白解吸附平衡常數(shù)，mol/L。

［Db］由［Dtotal］－［D'］得到，［Dtotal］是藥物與鍵合蛋白微球結(jié)合總量。以［Db］/［D'］為縱軸，［Db］為橫軸，繪圖見圖8，擬合線性方程 y=－2.09×104x+0.200 1，斜率即為瑞替加濱與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù) Ka=2.09×104L/mol。將微球用 PBS洗凈干燥后連續(xù)測定3次，計(jì)算 Ka為(2.09±0.025)×104L/mol。

圖7 吸附前后上清瑞替加濱液相色譜圖Fig.7 Chromatogram of Retigabine of supernatant before and after adsorption

圖8 瑞替加濱藥物的Rosenthal曲線Fig.8 Rosenthal plots of Retigabine

2.6 熒光光譜法測定結(jié)合常數(shù)

以285 nm波長為激發(fā)光，熒光滴定結(jié)果見圖9。

由圖9可知，在374，695 nm處有兩個最大發(fā)射峰。隨著滴加藥物濃度增加(箭頭方向)，兩個波長處的熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸降低，且兩峰均出現(xiàn)藍(lán)移。BSA熒光發(fā)射峰與其色氨酸殘基內(nèi)環(huán)境有關(guān)，藍(lán)移說明BSA腔內(nèi)疏水環(huán)境的極性減弱，疏水性增強(qiáng)，肽鏈?zhǔn)湛s。

以374 nm波長處熒光強(qiáng)度及對應(yīng)藥物濃度代入Stern-Volmer方程:

式中，F(xiàn)0為蛋白的初始熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為藥物濃度為［Q］時的熒光強(qiáng)度，［Q］為藥物濃度，K為淬滅常數(shù)即藥物蛋白結(jié)合常數(shù)。

擬合線性方程后得 K310.15=1.607 ×104L/mol，與SiO2-NH2微球測定結(jié)果一致。蛋白鍵合到微球表面有一定失活，而且熒光滴定法采用的公式不同，Ka計(jì)算值也不同，這可能是造成結(jié)果微小差別的原因。

圖9 37℃下瑞替加濱與BSA結(jié)合的熒光光譜圖Fig.9 Fluorescence spectra of Retigabine and BSA at 37℃

3 結(jié)論

以新型抗癲癇藥物瑞替加濱與牛血清白蛋白為模板，氨基化粒子為蛋白固定載體，用高效液相色譜紫外檢測法，測定了瑞替加濱與BSA的結(jié)合常數(shù)，并與傳統(tǒng)熒光滴定方法對比，兩者結(jié)果一致。微球經(jīng)洗滌后仍可重復(fù)使用，且不影響測量精密度。新方法實(shí)用、便捷、經(jīng)濟(jì)，可用于藥物蛋白結(jié)合常數(shù)的測定，為研究藥物小分子與蛋白大分子相互作用提供了新方法新思路。

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