張麗媛，姚笛，賈鵬宇，王穎，李秀波

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程研究中心）

牛乳及其制品以其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含鈣、維生素D等營(yíng)養(yǎng)成分而受到大眾的歡迎，但也因此成為摻假、制假的溫床。據(jù)報(bào)道，健康牛奶中平均含有0.9 mg·kg-1的硫氰酸離子，是乳制品過氧化物酶抗菌體系的主要成分之一。含乳飲料是以鮮乳或乳制品為原料，經(jīng)發(fā)酵或未經(jīng)發(fā)酵加工制成的制品，含乳飲料中摻入硫氰酸鈉后可有效的抑菌、保鮮，但硫氰酸鈉能在體內(nèi)釋放氰根離子，并很快與細(xì)胞色素氧化酶中的三價(jià)鐵離子結(jié)合，抑制該酶的活性，使組織不能利用氧而導(dǎo)致人昏迷[1]。另有報(bào)道稱，由于硫氰酸鈉在人體內(nèi)代謝可形成硫氰酸，可干擾人的甲狀腺功能，導(dǎo)致非缺碘性甲狀腺腫，影響人體正常生理代謝[2]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于硫氰酸鹽的研究多集中在化學(xué)和生物方面，如運(yùn)用硫氰酸鹽離子吸附形成復(fù)雜的離子交換劑[3]、硫氰酸鈉對(duì)銀腐蝕溶出度氨基硫脲解率的影響[4]等。在硫氰酸鈉檢測(cè)方法方面主要有毛細(xì)管電泳法[5]、離子色譜法[6]、分光光度法[7]、氣相色譜法[8]、電化學(xué)法[9]。張永峰[10-11]等建立了離子色譜/電導(dǎo)檢測(cè)分析奶粉、牛奶中硫氰酸鹽的方法，針對(duì)不同形態(tài)的乳制品前處理方法進(jìn)行重點(diǎn)研究和討論。宋潔[12]等利用頂空進(jìn)樣-氣相色譜法檢測(cè)乳制品中硫氰酸鹽的含量，采用蒸餾水提取乳制品中的硫氰酸鹽，用乙酸鋅沉淀乳制品中的蛋白質(zhì)，將硫氰酸離子衍生后，采用頂空進(jìn)樣，氣相色譜法檢測(cè)。

主要研究了乳飲料中硫氰酸鈉的前處理方法，利用乙腈加酸溶液沉淀蛋白，超聲輔助萃取乳飲料中的硫氰酸鈉，固相萃取柱進(jìn)行凈化，高效液相色譜法[13]進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)超聲時(shí)間、萃取條件等進(jìn)行討論和研究。

1 材料和方法

1.1 試劑

三氯乙酸、硫氰酸鈉、丙酮、乙醚、乙酸乙酯，以上均為分析純；甲醇、乙腈為色譜純。

硫氰酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取在80℃下烘2 h的硫氰酸鈉0.083 17 g于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻，即得濃度為500μg·mL-1的硫氰酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：將硫酸氰鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（500μg·mL-1） 逐級(jí)稀釋得到濃度為0.020、0.10、0.50、2.50、12.50、20.00 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

0.02 moL·L-1磷酸鹽緩沖溶液：稱取含兩個(gè)結(jié)晶水的磷酸二氫鈉0.312 g，加水溶解并定容至100mL，加磷酸調(diào)節(jié)pH=4.0，經(jīng)0.22μm微孔濾膜（水相）過濾后備用。

1.2 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀（PC-2025型，美國(guó)SSI有限公司），配紫外檢測(cè)器；超聲波儀（上海生析超聲波儀器有限公司）；分析天平（Mettler AE240，瑞士）；高速離心機(jī)（安徽中科中佳儀器有限公司）；一次性水系（纖維素）、有機(jī)系（尼龍）針式濾膜（0.22μm，天津市蘭博儀器公司）。

1.3 加標(biāo)樣品

乳飲料：乳飲料樣品共5種，復(fù)原乳樣品、爽歪歪，AD鈣奶和味動(dòng)力及優(yōu)酸乳分別設(shè)為樣品1、2、3、4、5，均購(gòu)買自超市。在2.2.2中的樣品分別是樣品1、2、3、4、5，其他所有結(jié)果都是由樣品1獲得。在乳飲料樣品中加入硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液并振搖2 min獲得加標(biāo)樣品溶液。

1.4 萃取過程

準(zhǔn)確稱取5 g試樣于50 mL離心管中，加入5.0μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL，振搖混均后向其加入少量去離子水、2mL 0.1moL·L-1三氯乙酸和30 mL乙腈，最后用去離子水定容，超聲提取10 min，14 000 r·min-1離心5 min，靜置，取上清液濾入10 mL離心管中，氮?dú)獯蹈桑萌ルx子水定容。過經(jīng)2mL甲醇、2 mL水活化后的C18固相萃取小柱，收集流出液，過0.22μm有機(jī)濾膜待測(cè)。在50mL離心管中，不加入乳飲料，其他按照上述過程依次處理，過膜后得到空白樣品溶液待測(cè)。

1.5 硫氰酸鈉的HPLC測(cè)定

色譜條件：色譜柱：XDB C18柱（5 mm，4.6 mm×150 mm）；C18（4.0 mm×50 mm） 保護(hù)柱。流動(dòng)相：0.02 moL·L磷酸鹽緩沖溶液-乙腈（50∶50）；流速：0.5 mL·min-1；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm；定量環(huán)體積：20μL。

將空白樣品溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液、加標(biāo)樣品溶液和樣品溶液依次按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，得到色譜圖以及峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的確定

樣品前處理的基本原則是：首先用去離子水對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行提取，再采用有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)，進(jìn)而用固相萃取小柱凈化、去除脂肪等有機(jī)物，得到測(cè)試液。鑒于硫氰酸鈉無機(jī)鹽的屬性以及定量計(jì)算方便，選擇三氯乙酸加有機(jī)溶劑沉淀蛋白—超聲提取—固相萃取柱凈化的前處理方法，可以有效去除蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì)的影響，有利于提高提取效率和凈化效果，得到較滿意的結(jié)果。

2.1.1 蛋白沉淀劑的選擇

蛋白沉淀劑的選擇直接影響著后續(xù)HPLC法的分析性能?？疾觳煌袡C(jī)溶劑甲醇、丙酮、乙腈以及酸溶液、堿溶液對(duì)乳飲料樣品的蛋白沉淀效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。單一選擇有機(jī)溶劑進(jìn)行蛋白沉淀時(shí)易出現(xiàn)分層現(xiàn)象，結(jié)合圖1結(jié)果中回收率情況，加入2 mL 0.1 moL L-1三氯乙酸和30 mL乙腈進(jìn)行蛋白沉淀，可以更有效的去除乳飲料中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。

2.1.2 超聲時(shí)間

在超聲功率150W、溫度25℃條件下，考察超聲時(shí)間范圍變化從5、7、10、13、15 min對(duì)回收率的影響。結(jié)果如圖1，隨著超聲時(shí)間增加，樣品中硫氰酸鈉提取回收率隨之增加，超聲時(shí)間增加到一定時(shí)間后提取回收率無明顯影響。因此選擇10 min為最優(yōu)超聲時(shí)間。

圖1 蛋白沉淀劑的影響Fig.1 Effectof protein precipitation agent

圖2 超聲時(shí)間的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time

圖3 SPE類型的影響Fig.2 Effectof type of SPE cartridges

圖4 柱溫的影響Fig.4 Effectof column temperature

2.1.3 固相萃取柱類型

選擇固相萃取柱的主要目的是凈化，因?yàn)橹饕蓴_硫氰酸鈉檢測(cè)的雜質(zhì)包括蛋白質(zhì)，脂肪、氨基酸和水溶性維生素。研究進(jìn)一步考察HLB、MCX、Si、C18、C8（規(guī)格均為300mg，6mL）5種不同填料的SPE柱，結(jié)果如圖3。結(jié)果表明C18柱對(duì)樣品凈化效果最好。

2.1.4 柱溫的影響

色譜柱的柱溫對(duì)硫氰酸鈉的分離分析有一定的影響，升高柱溫可以保留時(shí)間提前，分離效果變好，但是升高到一定程度后保留時(shí)間變化不明顯，還會(huì)影響分離效果。見圖4，最終選擇35℃為最佳柱溫。

2.2 方法評(píng)價(jià)

2.2.1 線性關(guān)系

以硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和所得色譜峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程；同時(shí)得到硫氰酸鈉的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。LOD和LOQ均由以下公式得到：

σ是11個(gè)空白樣品直接引入到HPLC分析得到的信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k是曲線的斜率。所得數(shù)據(jù)如表1。

表1 工作曲線和線性范圍Table1 Working curves and Linear range

2.2.2 樣品分析

通過評(píng)價(jià)方法的精密度和回收率分析5種乳飲料樣品，（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液、（2）空白樣品1溶液、（3）加標(biāo)樣品1溶液、（4）牛奶樣品2如圖5所示。7種牛奶樣品都檢出硫氰酸鈉，檢出量數(shù)據(jù)如表2。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)溶液（1），空白溶液（2），加標(biāo)樣品溶液（3），樣品溶液（4）的色譜圖Fig.5 Chromatograms of standard solution（1），blank solution（2），spiked sample solution（3），sample solution（4）

表2 硫氰酸鈉檢出量Table2 Detectable amountof Sodium Thiocyanate

對(duì)于同一個(gè)樣品分別加入兩個(gè)不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.00、20.00μg·kg-1），每一個(gè)樣品一天內(nèi)分析三次，求得日內(nèi)精密度；三天內(nèi)每天分析一次，求得日間精密度，都是由相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。

表3 牛奶樣品的分析結(jié)果Table3 Analytical results of dairy samples

3 結(jié)論

建立了超聲輔助萃取/固相萃取柱凈化/高效液相色譜快速測(cè)定乳飲料中硫氰酸鈉的方法，針對(duì)樣品前處理技術(shù)進(jìn)行研究，并對(duì)萃取、凈化條件進(jìn)行優(yōu)化。3min完成硫氰酸鈉的檢測(cè)，并在0.05～50mg·kg-1范圍內(nèi)具有良好的線性，檢測(cè)限為0.024mg·kg-1。經(jīng)此方法檢測(cè)5種乳飲料樣品，（下均檢出不同程度的硫氰酸鈉殘留，最高達(dá)到95.40mg·kg-1。經(jīng)檢測(cè)樣品2—爽歪歪、3—AD鈣奶、5—優(yōu)酸乳疑似添加，飲用不安全。此方法前處理簡(jiǎn)單、分析快速，為乳飲料中硫氰酸鈉的質(zhì)量監(jiān)控提供了可靠的檢測(cè)手段。

[1]伍金娥，常超，胡海瓊，等.紫外分光光度法測(cè)定摻假牛奶中的硫氰酸鈉含量[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，29（2）：1-3.

[2]顧欣，黃士新，李丹妮，等.乳中硫氰酸鹽對(duì)人類健康的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J].中國(guó)獸藥雜志，2010，44（9）：45-49.

[3]Kononova O N，Goryaeva N G，Kononov Y S，The sorption of thiocyanate ions on complex forming ionites[J].Zhurnal Fizicheskoi Khimii，2011，85（6）：1142-1147.

[4]Kozin L F，Danil’tsev B I.The Effect of sodium thiocyanate on the corrosion dissolution rate of silver in thiosemicarbazide solutions[J].Zashchita Metallov，2005，41（4）：372-380.

[5]Glatz z，NovákováS，sˇtěrbováH.Analysis of thiocya-nate in biological fluids by capillary zone electrophoresis[J].J.Chromatrogr.A，2001，916（1-2）：273-277.

[6]劉明.離子色譜法快速測(cè)定原料乳中硫氰酸鹽含量的研究[J].安徽工程科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25（2）：47-49.

[7]水明，趙慧芬，曹燕淑.可見分光光度法測(cè)定牛乳中硫氰酸鈉[J].中國(guó)奶牛，2009（11）：50-51.

[8]胡桂林，薛志清，張河霞，等.氣相色譜法測(cè)定牛奶和奶粉中的硫氰酸鹽[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2010，38（10）：54-56.

[9]Shamsipur M，Ershad S，Samadi N，et al.The first use of a Rh（Ⅲ）complex as a novel ionophore for thiocyanateselective polymeric membrane electrodes[J].Talanta，2005，65（4）：991-997.

[10]張水鋒，林珍珍，陳小珍，等.基于離子色譜/電導(dǎo)檢測(cè)的全脂奶粉中硫氰酸鹽污染物的測(cè)定及前處理方法研究[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2012，31（1）：85-89.

[11]張永峰，陳小珍，張東雷，等.離子色譜-電導(dǎo)檢測(cè)法測(cè)定不同乳制品中硫氰酸鹽[J].中國(guó)無機(jī)分析化學(xué)，2012，2（3）：60-63.

[12]宋潔，傅英文，杜利君，等.頂空進(jìn)樣-氣相色譜法檢測(cè)乳制品中硫氰酸鹽的含量[J].色譜，2012，30（7）：743-746.

[13]張麗媛，姚笛，何瑩，等.固相萃取-高效液相色譜法聯(lián)用檢測(cè)花椒樣品中的玫瑰紅B[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，24（6）：53-57.