夏 寧，曾 慶，李曉瑾，劉立新，劉志偉

荷葉黃酮是荷葉的主要生物活性成分之一。研究表明，黃酮具有降血脂、降血壓、抗菌、抗氧化等生理功能，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[1－4］。作者在此對(duì)荷葉總黃酮水溶提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，擬為水溶法提取荷葉總黃酮的規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

荷葉由武漢華康臣生物科技有限公司提供。將產(chǎn)自武漢蔡甸區(qū)的干燥荷葉粉碎，過40目篩，備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、四硼酸鈉，均為分析純。

分光光度計(jì)，電熱鼓風(fēng)干燥箱，高速離心機(jī)，電子天平，恒溫水浴鍋，真空抽濾機(jī)，粉碎機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取120℃干燥至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，加80%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇溶解，定容至50mL容量瓶中，搖勻，得到總黃酮含量為0.2mg·mL－1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0mL、0.2mL、0.5 mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL于10mL比色管中，加入5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻；靜置5min后加入10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻；靜置5min后加入4%氫氧化鈉溶液4mL，再用30%乙醇溶液定容至10mL，搖勻；靜置15min后，于408nm波長處測(cè)定吸光度A。以蘆丁總黃酮濃度c（mg·mL－1）為橫坐標(biāo)、以吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。以未添加蘆丁的相應(yīng)溶液作空白對(duì)照。

1.2.2 提取方法

稱取3.0g荷葉細(xì)粉，加入少量的助溶劑混合，然后加入一定量的蒸餾水，攪拌均勻；在不同溫度下提取不同時(shí)間，自然冷卻20min左右，經(jīng)真空抽濾后蒸發(fā)濃縮；將濃縮液定容至100mL的容量瓶中，即得到供試品溶液。

由于荷葉黃酮類化合物主要是荷葉苷、槲皮素和異槲皮素，該類化合物含有酚羥基，所以在荷葉總黃酮水溶法提取過程中一般加入少量的硼酸作為助溶劑。本實(shí)驗(yàn)選用碳酸鈉和四硼酸鈉（1∶1，質(zhì)量比）作為助溶劑，助溶劑總量占荷葉干質(zhì)量的20%。

1.2.3 工藝優(yōu)化

先分別考察料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，g∶mL，下同）、提取溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃）和提取時(shí)間（5min、10min、15min、20min、25min、30min）對(duì)荷葉總黃酮得率的影響。再依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化工藝條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程（圖1）

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of lutin solution

對(duì)蘆丁總黃酮濃度c（mg·mL－1）與吸光度A進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A＝10.557c－0.0092，R2＝0.9995。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 料液比對(duì)荷葉總黃酮得率的影響（圖2）

圖2 料液比對(duì)荷葉總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of solid－liquid ratio on yield of total flavonoids from lotus leaves

由圖2可以看出，料液比為1∶40時(shí)的荷葉總黃酮得率最高，料液比過大或者過小都不利于總黃酮的提取。這是因?yàn)?，料液比過小，總黃酮溶解不充分；料液比過大，不僅浪費(fèi)溶劑，同時(shí)也會(huì)溶解大量的雜質(zhì)，使后續(xù)的黃酮純化工序更加復(fù)雜。因此，選擇料液比為1∶40左右。

2.2.2 提取溫度對(duì)荷葉總黃酮得率的影響（圖3）

由圖3可以看出，荷葉總黃酮得率隨提取溫度的升高先升高后緩慢降低，在提取溫度為80℃時(shí)，達(dá)到最高。這可能是因?yàn)?，總黃酮的結(jié)構(gòu)在一定溫度范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，當(dāng)溫度升高到某個(gè)程度，其結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生變化，致使總黃酮得率降低。一般來說，提取溫度越高，分子運(yùn)動(dòng)越劇烈，溶解越快，物質(zhì)更易溶出；但隨著提取溫度的進(jìn)一步升高，黃酮類物質(zhì)會(huì)被氧化導(dǎo)致其含量不再增加且可能下降。因此，選擇提取溫度為80℃左右。

圖3 提取溫度對(duì)荷葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of total flavonoids from lotus leaves

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)荷葉總黃酮得率的影響（圖4）

圖4 提取時(shí)間對(duì)荷葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on yield of total flavonoids from lotus leaves

由圖4可以看出，荷葉總黃酮得率在提取時(shí)間為20min時(shí)達(dá)到最高，表明長時(shí)間提取并不利于總黃酮得率的提高，而且容易使后續(xù)操作更加繁瑣。因此，選擇提取時(shí)間為20min左右。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以料液比、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素，以荷葉總黃酮得率為考核指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1 ，結(jié)果與分析見表2 。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

由表2 數(shù)據(jù)分析得出的優(yōu)化方案是A2B1C3，而正交實(shí)驗(yàn)的4＃方案（A2B1C2）的總黃酮得率最高。因此，將優(yōu)化方案與4＃方案重新進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，比較總黃酮得率，以篩選荷葉總黃酮的最優(yōu)提取方案。

表2 L9（33）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.2 Results and analysis of L9（33）orthogonal experiment

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：按優(yōu)化方案測(cè)得的總黃酮吸光度為0.743、0.751、0.758，平均值為0.751，小于4＃方案的吸光度（0.790）。因此，選擇正交實(shí)驗(yàn)的4＃方案（A2B1C2）為荷葉總黃酮提取的最優(yōu)方案，即料液比1∶50（g∶mL）、提取溫度75℃、提取時(shí)間15min。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

傳統(tǒng)方法：以50%乙醇溶液作為溶劑。取干荷葉3.0g，加50%乙醇150mL，攪拌均勻，常溫下提取20 min。平行實(shí)驗(yàn)3次，測(cè)得荷葉總黃酮的平均得率為2.11%。

在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得荷葉總黃酮的平均得率為2.49%，較傳統(tǒng)方法提高0.38%。

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定水溶法提取荷葉總黃酮的最佳工藝條件為：料液比1∶50（g∶mL）、提取溫度75℃、提取時(shí)間15min，在此條件下，荷葉總黃酮的平均得率達(dá)到2.49%，較傳統(tǒng)方法提高0.38%。

[1]蔡為榮.微波提取荷葉黃酮及其清除羥基自由基的研究[J］.食品科學(xué)，2004，25（9）：112－115.

[2]鐘先鋒，黃桂東.荷葉成分及功能的研究進(jìn)展[J］.食品與機(jī)械，2006，22（4）：138－140.

[3]王洋.機(jī)械化學(xué)法在植物有效成分提取中的應(yīng)用[D］.大連：遼寧師范大學(xué)，2008.

[4]陳海光，余以剛，曾慶孝.荷葉黃酮及生物堿的提取研究[J］.食品科學(xué)，2003，23（1）：69－72.