靖 鈺，張存超，付 托，蔣 成，張學(xué)光，寇 庚

（1.蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所，江蘇 蘇州215007；2.第二軍醫(yī)大學(xué) 腫瘤研究所，上海200433）

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）是表達(dá)單克隆抗體最常用的工程細(xì)胞，凋亡是CHO細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞死亡的主要方式，限制了細(xì)胞密度和蛋白表達(dá)量的提高。細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞的程序性死亡，是細(xì)胞在多種因素誘導(dǎo)下的自殺行為，其途徑分為外在途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[1］。其中線粒體途徑由應(yīng)激條件、化學(xué)治療試劑和藥物所啟動(dòng)。

活性氧（ROS）是一類氧衍生的自由基的總稱，通常包括氧離子、過氧化物和自由基等，可通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2］，是細(xì)胞凋亡的重要誘導(dǎo)因素。因此，通過降低活性氧可以減少細(xì)胞凋亡，如TIGAR過表達(dá)可降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平[3］，進(jìn)而減少凋亡。

人蘋果酸脫氫酶Ⅱ（human malate dehydrogenaseⅡ，hMDHⅡ）位于線粒體內(nèi)，是TCA循環(huán)中的一種酶，可以將蘋果酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸。研究顯示，在CHO細(xì)胞中過表達(dá)hMDHⅡ能提高細(xì)胞內(nèi)ATP和NADH水平，并增大活細(xì)胞密度[4］，但缺乏此基因過表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡影響的研究。

作者以CHO－K1細(xì)胞為研究對(duì)象，考察hMDHⅡ過表達(dá)對(duì)活性氧誘導(dǎo)CHO細(xì)胞凋亡的影響，擬為理解活性氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡提供理論支持，為抗凋亡細(xì)胞株構(gòu)建提供新的途徑。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

CHO－K1細(xì)胞、E.coli TG1，自行保存。

限制性內(nèi)切酶（Takara Code：DRR037A），Takara公司；DNA片段小量膠回收試劑盒（W5001）、質(zhì)粒小量抽提試劑盒（W5211），上海生工生物技術(shù)公司；RNA提取試劑（No.740955.50），Macherey－Nagel公司；DNA marker，天根生化科技北京有限公司；淋巴細(xì)胞分離液，上海華精生物高科技有限公司；PCR、反轉(zhuǎn)錄試劑及DNA連接試劑盒，Promega公司；轉(zhuǎn)染試劑盒l(wèi)ipofectamine 2000，Invitrogen公司；G418試劑，Roche公司；JC－1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；DCFH－DA試劑，Sigma公司。

ABI 7500型 Real－time PCR 儀，Applied Biosystems公司；BD FACSCALIBUR型流式細(xì)胞儀，BD Bioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 hMDHⅡ基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

hMDHⅡ的編碼序列（NM＿005918.2）長(zhǎng)度為1 017 bp。為此序列設(shè)計(jì)并合成PCR引物（上海生工生物技術(shù) 公 司），F(xiàn)：CCCAAGCTTGCCACCATGCTCTCCGCCCTCGCCCG，R：CGGAATTCTCACTTCAGGGGTCTTCACGAA。分別在此引物對(duì)中添加HinDⅢ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。

從人血液淋巴細(xì)胞中提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此作為PCR模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（退火溫度為50℃，30s，35個(gè)循環(huán)），PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 045bp。將PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離并鑒定，判定并切割目的條帶進(jìn)行膠回收，用于后續(xù)與克隆載體連接。

以pGEM－T作為克隆載體，將膠回收產(chǎn)物與其連接，通過轉(zhuǎn)化、涂布平板、挑取克隆、測(cè)序等步驟獲得含有正確hMDHⅡ序列（用于后續(xù)表達(dá)載體構(gòu)建）的克隆載體。以pcDNA3.0作為表達(dá)載體，經(jīng)HinD Ⅲ和EcoRⅠ酶切后與同樣經(jīng)相同酶酶切后的hMDHⅡ序列連接，經(jīng)過與上述克隆載體構(gòu)建相同的步驟獲得表達(dá)載體，測(cè)序確認(rèn)其序列。

1.2.2 轉(zhuǎn)染與篩選及熒光定量PCR鑒定[5］

用含有hMDHⅡ的pcDNA3.0表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO－K1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染使用lipofectamine 2000試劑，以800μg·mL－1G418作為篩選壓力，獲得G418抗性細(xì)胞。用有限稀釋法篩選這些抗性細(xì)胞獲得單克隆，并用 Real－time PCR法鑒定所獲得的克隆。以β－actin基因作內(nèi)參，其PCR引物參照文獻(xiàn)[6］。hMDHⅡ進(jìn)行熒光定量PCR的引物為：F：AGAAAGCCAGGCATGACCCG，R：TGTGATGGGGATGGTGGAATTA。PCR采用兩步法，退火／延伸溫度為60℃，35s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

直接更換經(jīng)鑒定的hMDHⅡ陽(yáng)性克隆的培養(yǎng)基為CHOM－B01＋4mmol·L－1Gln，待細(xì)胞懸浮后，轉(zhuǎn)移至100mL搖瓶培養(yǎng)，初始接種密度為5×105個(gè)·mL－1，裝液量為30mL，細(xì)胞每3d傳代1次。

補(bǔ)料分批培養(yǎng)時(shí)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為CHOM－B01＋4 mmol·L－1Gln，并添加自主開發(fā)的流加培養(yǎng)基。初始接種密度為5×105個(gè)·mL－1，裝液量為30mL。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

使用JC－1檢測(cè)線粒體膜電位，線粒體膜電位的缺失可用于指示細(xì)胞凋亡：線粒體膜電位較高時(shí)，JC－1在線粒體的基質(zhì)中以聚合物形式存在，此時(shí)產(chǎn)生紅色熒光；而線粒體膜電位較低時(shí)，JC－1因不能在線粒體中聚集而以單體形式存在，此時(shí)產(chǎn)生綠色熒光。具體操作如下[7］：取1×105～6×105個(gè)細(xì)胞，重懸于0.5 mL無血清培養(yǎng)基中，加入 0.5mL JC－1（5mg·mL－1）染色工作液，顛倒數(shù)次混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20min后，4℃、600g離心3～4min，沉淀細(xì)胞。棄上清，細(xì)胞用PBS緩沖溶液洗滌2次。用500μL PBS緩沖溶液重懸后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用488nm光激發(fā)并在530nm和575nm波長(zhǎng)處收集信號(hào)，以熒光強(qiáng)度比（綠光／紅光）表征線粒體膜的去極化情況。

對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞，通常10μmol·L－1羰基氰化氯苯 腙 （carbonyl cyanide 3－chlorophenylhydrazone，CCCP）處理20min后線粒體的膜電位會(huì)完全喪失，經(jīng)JC－1染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng)JC－1染色后應(yīng)顯示紅色熒光。因此，兩者分別用作陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.2.5 活性氧檢測(cè)

取1×106個(gè)細(xì)胞離心后用1mL新鮮無血清培養(yǎng)基重懸，置于24孔板中，加入10μL 10μmol·L－1DCFH－DA試劑。置于培養(yǎng)箱中37℃避光孵育30 min，期間每隔3～5min輕輕搖晃24孔板，使得細(xì)胞與DCFH－DA探針充分結(jié)合。取上述1mL細(xì)胞液以1 000r· min－1離心5min，棄上清并用預(yù)冷PBS緩沖溶液洗滌，最終重懸于500μL PBS緩沖溶液中。用流式細(xì)胞儀在激發(fā)光488nm、發(fā)射光525nm處檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 hMDHⅡ基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

以人淋巴細(xì)胞cDNA為模板，使用hMDHⅡ基因克隆引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物的凝膠電泳鑒定如圖1所示。

圖1 hMDHⅡ基因PCR產(chǎn)物電泳鑒定Fig.1 Electrophoresis identification of hMDHⅡgene PCR product

從圖1可見，在約1 000bp位置有一條明亮的條帶，將此條帶膠回收后與pGEM－T載體連接并轉(zhuǎn)化至E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞，隨后挑選5個(gè)克隆用于測(cè)序，依次編號(hào)為1?！?＃。測(cè)序結(jié)果表明，5?？寺≈衕MDHⅡ序列與目的序列一致。將hMDHⅡ－pGEMT 5＃質(zhì)粒，按1.2.1方法制備成表達(dá)載體，命名為hMDHⅡ－pcDNA3.0，此載體序列經(jīng)DNA測(cè)序確認(rèn)無誤。

2.2 hMDHⅡ的mRNA水平鑒定

將hMDHⅡ－pcDNA3.0和pcDNA3.0載體分別轉(zhuǎn)染CHO－K1細(xì)胞，用有限稀釋法篩選獲得6株具有G418抗性的穩(wěn)定單克隆，依次編號(hào)為1?！?＃。分別從這些克隆中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此為模板用熒光定量PCR法鑒定hMDHⅡ的表達(dá)。結(jié)果顯示，編號(hào)為2＃、3＃和6＃的克隆均表達(dá)hMDHⅡ，并且6?？寺MDHⅡ表達(dá)量最高（圖2）。取hMDHⅡ表達(dá)量最高的6?？寺∮糜诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 Real－time PCR鑒定hMDHⅡ基因表達(dá)Fig.2 Relative hMDHⅡ mRNA quantity determined by Real－time PCR

2.3 hMDHⅡ過表達(dá)抑制活性氧壓力下的CHO細(xì)胞凋亡

以6?？寺檠芯繉?duì)象，考察hMDHⅡ過表達(dá)對(duì)CHO細(xì)胞活率的影響，同時(shí)，為考察活性氧對(duì)細(xì)胞的影響，在補(bǔ)料分批培養(yǎng)第5d向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加過氧化氫以模擬活性氧條件，結(jié)果見圖3。

圖3 hMDHⅡ過表達(dá)對(duì)過氧化氫壓力下的CHO細(xì)胞活率的影響Fig.3 Effect of over－expression of hMDHⅡon survival rate of CHO cell under the condition of hydrogen peroxide treatment

從圖3可見，添加0.1mmol·L－1過氧化氫之后，CHO細(xì)胞的活率逐漸下降；在補(bǔ)料分批培養(yǎng)第9d、10 d，hMDHⅡ6＃細(xì)胞的活率顯著高于對(duì)照組，尤其是第10d時(shí)兩者差異更為顯著。

凋亡是細(xì)胞培養(yǎng)后期細(xì)胞死亡的主要方式，推測(cè)補(bǔ)料分批培養(yǎng)第10d細(xì)胞活率的差異可能是凋亡引起的。將補(bǔ)料分批培養(yǎng)第10d的細(xì)胞用于線粒體膜電位檢測(cè)，結(jié)果見圖4。

圖4 hMDHⅡ過表達(dá)提高線粒體膜電位Fig.4 Over－expression of hMDHⅡincreases mitochondrial membrane potential

從圖4可見，表達(dá)hMDHⅡ的細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比提高了約10倍；對(duì)照組無明顯紅色熒光，而表達(dá)hMDHⅡ的細(xì)胞可見少量紅色熒光。表明大部分細(xì)胞線粒體處于低能量狀態(tài)，而且表達(dá)hMDHⅡ細(xì)胞的線粒體膜電位高于對(duì)照組，證實(shí)hMDHⅡ過表達(dá)提高了線粒體膜電位，抑制了細(xì)胞凋亡。

2.4 hMDHⅡ過表達(dá)降低活性氧

測(cè)定補(bǔ)料分批培養(yǎng)第10dCHO細(xì)胞內(nèi)的活性氧，如圖5所示。圖中M1為熒光強(qiáng)度低的細(xì)胞，即活性氧水平低的細(xì)胞，M2為熒光強(qiáng)度高的細(xì)胞，即活性氧水平高的細(xì)胞。

從圖5可見，hMDHⅡ過表達(dá)后，M1數(shù)量明顯增加、M2數(shù)量大幅減少，總體熒光強(qiáng)度顯著降低，說明細(xì)胞內(nèi)活性氧減少，其平均活性氧水平是對(duì)照組的1／10左右?？梢?，在CHO細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)hMDHⅡ能夠顯著減少細(xì)胞內(nèi)的活性氧。

3 結(jié)論

圖5 hMDHⅡ過表達(dá)降低活性氧Fig.5 Over－expression of hMDHⅡ decreases ROS

成功構(gòu)建了過表達(dá)人蘋果酸脫氫酶Ⅱ（hMDHⅡ）的重組CHO細(xì)胞，并考察了hMDHⅡ過表達(dá)對(duì)過氧化氫壓力下CHO細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，hMDHⅡ過表達(dá)提高了過氧化氫壓力下的CHO細(xì)胞活率。進(jìn)一步的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hMDHⅡ過表達(dá)可能通過減少活性氧的產(chǎn)生從而抑制細(xì)胞凋亡。

[1]TAYLOR R C，CULLEN S P，MARTIN S J.Apoptosis：Controlled demolition at the cellular level[J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9（3）：231－241.

[2]CIRCU M L，AW T Y.Reactive oxygen species，cellular redox systems，and apoptosis[J］.Free Radic Biol Med，2010，48（6）：749－762.

[3]BENSAAD K，TSURUTA A，SELAK M A，et al.TIGAR，ap53－inducible regulator of glycolysis and apoptosis[J］.Cell，2006，126（1）：107－120.

[4]CHONG P K W，REDDYA G S，YUSUFIA N K F，et al.Metabolomics－driven approach for the improvement of Chinese hamster ovary cell growth：Overexpression of malate dehydrogenaseⅡ[J］.J Biotechnol，2010，147（2）：116－121.

[5]付托，張存超，靖鈺，等.人丙酮酸羧化酶異位表達(dá)提高中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞補(bǔ)料分批培養(yǎng)后期活率[J］.化學(xué)與生物工程，2013，30（6）：39－42.

[6]CHUSAINOW J，YANG Y S，YEO J H，et al.A study of monoclonal antibody－producing CHO cell lines：What makes a stable high producer[J］.Biotechnol Bioeng，2009，102（4）：1182－1196.

[7]LI Y，LI Q，WANG Z，et al.15－HETE Suppresses K＋channel activity and inhibits apoptosis in pulmonary artery smooth muscle cells[J］.Apoptosis，2009，14（1）：42－51.