李玉梅 趙銥民 查年保 舒震 張松

1.襄陽市中心醫(yī)院口腔科，襄陽 441021；2.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科；

3.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生物技術(shù)中心，西安 710032；4.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科，西安 710038

高劑量的放射治療會(huì)對正常的骨組織產(chǎn)生不良作用，如骨質(zhì)疏松、放射性骨壞死、顱面部骨生長遲緩等。1983年，Marx[1]提出了被廣泛接受的骨壞死病理機(jī)制：即射線引起動(dòng)脈內(nèi)膜炎，接著發(fā)生組織缺氧、細(xì)胞數(shù)減少以及血管減少，最終出現(xiàn)慢性不愈合的傷口。其后學(xué)者們的研究更加關(guān)注于骨細(xì)胞，并認(rèn)為骨細(xì)胞的改變要先于血管，而骨重建的抑制是發(fā)生骨壞死的關(guān)鍵所在[2]。本文擬從MC3T3-E1成骨前體細(xì)胞入手，探討60Co γ射線對成骨細(xì)胞增殖和分化的影響，為輻射骨損傷的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器設(shè)備

α-MEM培養(yǎng)基（HyClone公司，美國），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），β-磷酸甘油、抗壞血酸（西安沃爾森生物技術(shù)有限公司），3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻藍(lán) [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylte-trazolium bromide，MTT]（西安科昊生物工程有限責(zé)任公司）；黏膠纖維紅（Sigma公司，美國），茜素紅（西安舟鼎國生物技術(shù)有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）相關(guān)試劑（TaKaRa公司，日本）；酶標(biāo)儀（BIO-TEK公司，美國）；60Co源（第四軍醫(yī)大學(xué)鈷源室）；7500型qPCR儀（ABI公司，美國），基因擴(kuò)增儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)

采用MC3T3-E1成骨前體細(xì)胞系亞克隆14（上海中科院細(xì)胞庫）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用含10%新生牛血清、100 IU·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，常規(guī)換液與傳代。用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞成骨。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在上述培養(yǎng)基里添加5 mmol·L-1的β-磷酸甘油和50 μg·mL-1抗壞血酸。

1.3 細(xì)胞輻射

MC3T3-E1細(xì)胞接種24 h后進(jìn)行60Co γ射線照射。單次照射劑量分別為4、8 Gy，換液后繼續(xù)培養(yǎng)觀察。對照組帶入準(zhǔn)備室，但不接受照射。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以每孔1.5×103個(gè)的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后分別接受4、8 Gy射線照射。照射后1、3、5、7 d終止培養(yǎng)，PBS漂洗1次，每孔加入20 μL MTT（5 g·L-1）和200 μL無血清α-MEM培養(yǎng)基。37 ℃孵育4 h后吸棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶解生成的結(jié)晶物，室溫下振蕩20 min，然后置于分光光度儀上于490 nm處測量其光密度（optical density，OD）值。

1.5 細(xì)胞膠原分泌的測定

使用黏膠纖維紅染色法測定膠原分泌[3]。細(xì)胞以每孔7.5×104個(gè)的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后接受4、8 Gy射線照射。細(xì)胞接近融合后更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。輻射后第12天終止細(xì)胞培養(yǎng)，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3遍。0.1%黏膠纖維紅（溶于飽和苦味酸）染色18 h，鹽酸漂洗，細(xì)胞照相。定量分析時(shí)，加入氫氧化鈉溶解染色，570 nm處測量OD值。

1.6 成骨相關(guān)基因mRNA表達(dá)的測定

采用qPCR法檢測4種成骨相關(guān)基因mRNA的表達(dá)，分別為Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、轉(zhuǎn)錄因子Osterix（OSX）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和骨鈣素（osteocalcin，OCN）。細(xì)胞以每孔7.5×104個(gè)的密度接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后分別接受4、8 Gy射線照射。細(xì)胞接近融合后更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。輻射后第16天終止細(xì)胞培養(yǎng)，PBS漂洗后用適量Trizol裂解細(xì)胞，按試劑盒描述的步驟提取總RNA并定量。取1.0 μg總RNA，按照Prime Script RT reagent Kit說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。配制qPCR反應(yīng)液，所使用的引物見表1，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，置于7500型qPCR儀內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析，0 Gy組數(shù)據(jù)作為校正樣本。

表1 qPCR所使用的引物Tab 1 Primers used for qPCR

1.7 細(xì)胞基質(zhì)礦化測定

使用茜素紅染色測定細(xì)胞基質(zhì)礦化情況。細(xì)胞以每孔5×104個(gè)的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后接受4、8 Gy射線照射。細(xì)胞接近融合后更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。輻射后第28天終止細(xì)胞培養(yǎng)，PBS漂洗2次，75%乙醇固定1 h。40 mmol·L-1茜素紅染液（pH=4.2）室溫染色20 min，PBS漂洗5次后10%氯化十六烷基吡啶溶解染色，置于分光光度儀上于570 nm處測OD值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較各組均數(shù)之間有無差異，Tukey顯著差異法進(jìn)行均數(shù)之間的兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。與未輻射組相比，從輻射后第3天開始，4、8 Gy的輻射劑量均導(dǎo)致MC3T3-E1細(xì)胞的增殖明顯降低（P＜0.05），并且這種降低呈現(xiàn)劑量依賴性。

2.2 細(xì)胞膠原分泌

經(jīng)不同劑量的輻射后，MC3T3-E1細(xì)胞膠原分泌的染色情況見圖1：隨輻射劑量的增加，染色強(qiáng)度逐漸降低。對照組（0 Gy）、4 Gy和8 Gy組膠原定量分析的OD值分別為1.368±0.208、1.059±0.169和0.856±0.078，3組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.738，P=0.022），8 Gy組明顯低于對照組。

表2 經(jīng)不同劑量輻射后細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)的OD值Tab 2 The OD value of cells in MTT assay under different radiation doses

圖1 經(jīng)不同劑量輻射后細(xì)胞的膠原分泌 黏膠纖維紅染色 × 6.3Fig 1 Collagen secretion by cells under different radiation doses sirius red staining × 6.3

2.3 成骨相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

4種成骨相關(guān)基因的表達(dá)見表3：4 Gy以上射線可以明顯抑制MC3T3-E1細(xì)胞OSX和OCN基因的表達(dá)（P＜0.05），但對RUNX2基因無明顯影響（P＞0.05）；8 Gy射線可輕微下調(diào)細(xì)胞OPN基因的表達(dá)，但與對照組相比差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 經(jīng)不同劑量輻射后細(xì)胞成骨相關(guān)基因的表達(dá)Tab 3 Expression of osteogenesis-related genes of cells under different radiation doses

2.4 細(xì)胞基質(zhì)礦化

對照組（0 Gy）、4 Gy和8 Gy組細(xì)胞基質(zhì)礦化定量分析的OD值分別為2.155±0.257、1.728±0.265、1.485±0.042，3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.497，P=0.023），隨著射線劑量增大細(xì)胞基質(zhì)礦化降低，8 Gy照射組與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

MC3T3-E1成骨前體細(xì)胞系來源于新生小鼠顱頂骨，在體外可以分化為骨細(xì)胞，是較常用的研究射線對成骨細(xì)胞影響的細(xì)胞系之一[4]。檢測射線對細(xì)胞增殖影響的主要方法有克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT法、細(xì)胞計(jì)數(shù)以及DNA含量測定等。MTT實(shí)驗(yàn)是測試射線對細(xì)胞活性影響可靠、方便的方法之一。通過MTT實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)，從輻射后第3天開始，4 Gy以上的輻射劑量顯著降低了MC3T3-E1細(xì)胞的增殖，與以往文獻(xiàn)[4-6]報(bào)道一致。

骨的有機(jī)成分主要是Ⅰ型膠原，而黏膠纖維紅染色能特異性檢測Ⅰ型和Ⅲ型膠原，并能夠在原位確定產(chǎn)生膠原的細(xì)胞[3]。本研究顯示，8 Gy射線顯著抑制了MC3T3-E1細(xì)胞膠原分泌，與Gal等[6]的研究結(jié)果類似。本研究采用茜素紅染色及定量分析對MC3T3-E1細(xì)胞基質(zhì)礦化能力進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，8 Gy射線導(dǎo)致細(xì)胞礦化能力顯著降低。Gevorgyan等[7]研究證明，15 Gy射線可引起兔眶顴復(fù)合體骨膜來源成骨細(xì)胞礦化能力明顯下降。

本研究進(jìn)一步探討了射線對于MC3T3-E1細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響。RUNX2是與果蠅蛋白Runt同源的成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，可與成骨特異順式作用元件結(jié)合，調(diào)節(jié)OCN、Ⅰ型膠原α1鏈（collagen type Ⅰα1-chain，Col-Ⅰα1）和OPN基因的表達(dá)。本研究表明，在輻射后第16天，8 Gy射線并沒有引起RUNX2基因mRNA水平的改變；Sch?nmeyr等[8]的研究也得出相似的結(jié)論。OSX是另一個(gè)重要的成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，位于RUNX2的下游。在多能間充質(zhì)干細(xì)胞向前成骨細(xì)胞分化過程中，RUNX2起了重要作用，而在其后的調(diào)控前成骨細(xì)胞向成熟成骨細(xì)胞分化的過程中，RUNX2的表達(dá)下調(diào)，OSX則成為主要的作用基因[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，4 Gy以上射線顯著抑制了細(xì)胞OSX基因的表達(dá)，由此推測，射線有可能在成骨過程的中晚期通過下調(diào)OSX基因的表達(dá)來抑制細(xì)胞的分化能力。OPN是一種酸性糖蛋白，在成骨細(xì)胞增殖期有低表達(dá)，隨后下降；在細(xì)胞礦化起始期（第16～20天）第2次表達(dá)并達(dá)到峰值。OCN在礦化結(jié)節(jié)形成時(shí)才開始表達(dá)，是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志[10]。本研究顯示，射線可抑制OCN基因的表達(dá)，隨著射線劑量的增加，抑制作用增強(qiáng)，與其他文獻(xiàn)[5,11]報(bào)道一致。對于OPN基因，射線并無明顯下調(diào)作用。Matsumura等[11]發(fā)現(xiàn)，MC3T3-E1細(xì)胞接受10 Gy射線照射后，輻射后第16天OPN的表達(dá)與未照射組相比無明顯改變。

本研究從細(xì)胞和分子層面揭示了輻射骨損傷發(fā)生的可能機(jī)制，證實(shí)60Co γ射線可以降低MC3T3-El成骨前體細(xì)胞的增殖、膠原分泌及基質(zhì)礦化能力，并可下調(diào)其成骨相關(guān)基因的表達(dá)。

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