王 炫，汪江波，薛棟升

（湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部，湖北 武漢430068）

我國(guó)是白酒生產(chǎn)大國(guó)，酒糟年產(chǎn)量超過3 000萬t［1］。由于白酒糟水分大，酸度高，極易腐爛變質(zhì)，不易保管和運(yùn)輸，除一部分白酒糟用作飼料或肥料，大部分成為廢棄物，既浪費(fèi)資源，又污染環(huán)境［2］。據(jù)分析，由于酒糟中含有淀粉（10%左右）、粗纖維（20%左右）、粗蛋白（7%～9%）［3］，能量和玉米幾乎相當(dāng)，且酒糟中含有微量的氨基酸，豐富的有機(jī)酸、磷脂和維生素，但直接作為飼料，動(dòng)物適口性不好且不利于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)吸收［4］。本文探討以混合菌種為發(fā)酵菌進(jìn)行酒糟發(fā)酵生產(chǎn)飼料的工藝條件，以改善酒糟作為飼料的營(yíng)養(yǎng)組成的，得到一種動(dòng)物適口性好、營(yíng)養(yǎng)豐富、易被動(dòng)物吸收的生物活性蛋白飼料，為飼料生產(chǎn)提供新的蛋白質(zhì)來源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料和配料 酒糟由勁牌有限公司陽新楓林酒廠提供，初始含水量為70.0%；麩皮購(gòu)于武漢南湖農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，初始含水量1.3%。

1.1.2 菌 種 白 地 霉 （Geotrichu m candidiu m，G.），購(gòu)于武漢大學(xué)微生物保藏中心；產(chǎn)軟假絲酵母（Candida utilis，C.），實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.3 培養(yǎng)基 YPD培養(yǎng)基（種子培養(yǎng)基）：酵母膏，1%；蛋白胨，2%；葡萄糖，2%；水，1 000 mL；調(diào)整p H 至6.0，用于活化白地霉（G.）；調(diào)整p H 至6.5，用于活化產(chǎn)朊假絲酵母（C.）。

基本發(fā)酵培養(yǎng)基：酒糟與麩皮的干重比例（糟麩比）為9∶1，按基質(zhì)干重添加5%葡萄糖，0.5%CO（NH2）2、0.5% （NH4）2SO4、0.5%KH2PO4、0.1%MgSO4無機(jī)鹽，調(diào)整含水量為60%，并用Na OH調(diào)整p H至5.0。

1.2 主要儀器及試劑

見表1、表2.

1.3 分析方法

分析方法見表3.

表1 主要儀器

表2 主要試劑

表3 分析方法匯總

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種活化 斜面菌種一環(huán)→接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基→搖床（30℃，48h，180 r／min）→一級(jí)種子。

1.4.2 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) YPD液體培養(yǎng)基→分裝三角瓶（250 mL）→滅菌（115℃，30 min）→接種一級(jí)種子→培養(yǎng)（30℃，48 h，180 r／mi m）→二級(jí)種子。

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基→分裝三角瓶（500 mL）→滅菌→纖維素酶預(yù)處理（50℃、6 h）→接種（二級(jí)種子，接種量10%，V（G.）∶V（C.）＝1∶1）→培養(yǎng)（30℃，72 h，發(fā)酵24 h扣瓶）。

2 結(jié)果與討論

試驗(yàn)采取纖維素酶預(yù)處理酒糟，將其中的粗纖維降解為G.和C.可以利用的小分子的物質(zhì)以供菌種生長(zhǎng)并積累蛋白質(zhì)；添加麩皮補(bǔ)充氮源的同時(shí)，調(diào)整基質(zhì)的疏松度，增加基質(zhì)含氧量。

2.1 菌種生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

采用比濁法［6］確定G.和C.的生長(zhǎng)曲線。一級(jí)種子分別接種于YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h后，每隔2 h取樣，用可見分光光度計(jì)測(cè)其OD值（測(cè)定波長(zhǎng)為620 n m），記錄數(shù)據(jù)，并將所測(cè)的OD值與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，分別繪出G.和C.（YPD培養(yǎng)基，30℃，180 r／min）的生長(zhǎng)曲線（圖1）。所以，使用培養(yǎng)36 h的二級(jí)種子作為發(fā)酵菌種。

2.2 糟麩比對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響

培養(yǎng)基配方是充分利用原料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，最大限度完成生物轉(zhuǎn)化量的基礎(chǔ)［7］。以酒糟和麩皮（總干重20 g）為主要原料，V（酒糟）∶V（麩皮）分別按9∶1、8∶2、7∶3、6∶4配制發(fā)酵培養(yǎng)基，其他組成與基本發(fā)酵培養(yǎng)基一致，纖維素酶預(yù)處理后，接種G.和C.，30℃培養(yǎng)72h，烘干，測(cè)其蛋白質(zhì)含量，確定最佳糟麩比。定性檢測(cè)硫酸銨和尿素剩余與否［5］。

圖1 菌種G.和C.的生長(zhǎng)曲線

由圖2可知，添加麩皮比不添加的效果好，同時(shí)隨著麩皮所占比例增大，蛋白含量也增加，但所增幅度不大，所以選擇糟麩比為9∶1來配置發(fā)酵培養(yǎng)基。

圖2 糟麩比對(duì)蛋白含量的影響

2.3 纖維素酶預(yù)處理對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響

小曲白酒的原料經(jīng)過糖化和發(fā)酵，纖維素在酒糟中的比例明顯增高，添加纖維素酶［8］以降解粗纖維，以白地霉和假絲酵母來積累蛋白［9－10］。進(jìn)行纖維素酶添加量（預(yù)處理時(shí)間為6 h）和預(yù)處理時(shí)間（纖維素酶添加量為3%）對(duì)固態(tài)發(fā)酵影響的試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 纖維素酶添加量對(duì)固體發(fā)酵的影響

圖4 纖維素酶預(yù)處理時(shí)間對(duì)固體發(fā)酵的影響

由圖3和4可知，隨著纖維素酶的添加量和預(yù)處理時(shí)間的增加，蛋白含量也會(huì)隨著增加；纖維素酶量的增加到5%后，蛋白含量的增量不明顯，說明5%的纖維素酶足以將底物分解，確定5%的纖維素酶添加量；經(jīng)12 h 50℃高溫處理，蛋白含量可達(dá)到29.672 0%，隨時(shí)間的延續(xù)，蛋白含量反而降低，這可能與高溫下酶的半衰期縮短導(dǎo)致酶不能完全降解纖維素有關(guān)，但預(yù)處理時(shí)間增長(zhǎng)至24 h時(shí)，蛋白含量有上升趨勢(shì)，這可能與菌種在發(fā)酵初期有足夠的由纖維素酶降解的小分子物質(zhì)而大量生長(zhǎng)。在最適溫度下，預(yù)處理對(duì)蛋白的積累有益，但為了達(dá)到最好的生產(chǎn)效益，初步確定預(yù)處理時(shí)間約為12 h。

2.4 初始p H值對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響

由于發(fā)酵采用白地霉和假絲酵母混合菌種，兩菌種生長(zhǎng)的最適p H有所差異，而固態(tài)發(fā)酵過程中不必對(duì)微生物生長(zhǎng)環(huán)境中的p H加以測(cè)控，只要調(diào)好培養(yǎng)基的初始p H［11］。

由圖5可知，培養(yǎng)基初始p H5.0時(shí)，菌體蛋白含量最高28.329 8%。在發(fā)酵過程中，代謝產(chǎn)物的積累會(huì)影響菌種發(fā)酵能力，如酵母通過活躍分泌的H＋到培養(yǎng)基中降低p H值，固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的緩沖能力較大，p H的變化不會(huì)太大，故確定發(fā)酵初始p H值5.0作為發(fā)酵p H值。

2.5 初始含水量對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響

固態(tài)發(fā)酵的最大特點(diǎn)是沒有游離水，因此基質(zhì)含水量的變化必然會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)及代謝能力產(chǎn)生重要影響［11］。對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始含水量設(shè)置梯度，進(jìn)行試驗(yàn)。

圖5 初始p H值對(duì)酒糟固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的影響

由圖6可知，隨著初始含水量的上升，蛋白含量先上升后下降，70%的初始含水量，得到的發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量最高。這是由于含水量低則造成基質(zhì)膨脹程度低，微生物生長(zhǎng)受到抑制，發(fā)酵后期微生物生長(zhǎng)及蒸發(fā)使物料較干，微生物難以生長(zhǎng)，產(chǎn)量降低；而含水量過高，導(dǎo)致基質(zhì)多孔性降低，減少了基質(zhì)內(nèi)氣體的體積和氣體交換，難以通風(fēng)降溫。

圖6 初始含水量對(duì)固體發(fā)酵的影響

2.6 料層厚度對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響

為達(dá)到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的目標(biāo)，就一定要滿足好氧微生物對(duì)氧氣的需求量。三角瓶靜置培養(yǎng)的方式，其料層厚度——裝瓶量（按物料總干重計(jì)算）直接影響到基質(zhì)的含氧量，培養(yǎng)基厚度適中時(shí)，不僅使發(fā)酵反應(yīng)器得到最大的空間利用率，而且盡可能增加含氧量。由圖7可以看出，隨著裝瓶量的增加，所測(cè)得蛋白含量先增加后減少，在裝瓶量為15 g時(shí)達(dá)到最大值29.454%。

圖7 裝瓶量對(duì)蛋白含量的影響

2.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響

在30℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2 d、3 d、4 d、5 d、6 d，測(cè)其蛋白質(zhì)含量，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

由圖8可知，在發(fā)酵初期時(shí)，粗蛋白含量提高明顯，5 d之后蛋白含量積累較少。因?yàn)槲⑸镌谏L(zhǎng)過程中要經(jīng)歷遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定生長(zhǎng)期和衰亡期，菌種在協(xié)同發(fā)酵過程中，發(fā)酵后期到達(dá)衰亡期，其發(fā)酵能力大大下降。所以，確定最佳發(fā)酵時(shí)間為5 d。

圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白含量的影響

2.8 發(fā)酵溫度對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響

溫度可以充分影響微生物內(nèi)酶的活性，進(jìn)而影響微生物的生長(zhǎng)。在確定最適酶處理方式、初始p H值、最佳發(fā)酵時(shí)間、初始含水量、最佳糟麩比、料層厚度和發(fā)酵時(shí)間的基礎(chǔ)上，分別在25℃、30℃、35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，測(cè)其蛋白質(zhì)含量，以確定最佳培養(yǎng)溫度。

由圖9可知，白地霉和假絲酵母混菌發(fā)酵的最適溫度為30℃。溫度過低，蛋白含量不高，這是由于溫度低，微生物體內(nèi)的酶活力較低，微生物生長(zhǎng)繁殖慢，隨著溫度升高，細(xì)胞內(nèi)參與生命活動(dòng)的酶反應(yīng)速度加快，代謝和生長(zhǎng)也相應(yīng)加快，所積累的蛋白含量高；但溫度過高，蛋白含量亦不高，這是由于微生物體內(nèi)的活性物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、核酸等）失活，細(xì)胞功能下降，甚至死亡。

圖9 培養(yǎng)溫度對(duì)固體發(fā)酵的影響

2.9 正交試驗(yàn)

對(duì)單因素發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵厚度設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)（表4），以確定最佳的發(fā)酵條件。通過方差分析（表5），可以得到3個(gè)因素對(duì)發(fā)酵所積累蛋白含量的影響大小為：發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞初始含水量＞料層厚度。蛋白含量最高的實(shí)驗(yàn)小組為第六組，即發(fā)酵時(shí)間為120 h，發(fā)酵溫度為30℃，初始含水量為70%，料層厚度為5 c m（即12 g）。

表4 正交試驗(yàn)

表5 方差分析

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)確定初步發(fā)酵條件，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，得出結(jié)論：發(fā)酵培養(yǎng)基糟麩比為9∶1、初始含水量為70%、料層厚度為5 c m、p H值為5.0，滅菌后，添加5%的纖維素酶在50℃預(yù)處理12 h，再接種1∶1的白地霉和假絲酵母（10%），30℃培養(yǎng)120 h，可以混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)酒糟飼料蛋白含量達(dá)到30.094 8%。試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基無機(jī)鹽組成及含量未進(jìn)行探討分析，以后的試驗(yàn)還會(huì)探究。

［1］李日強(qiáng)，張 峰，韓文輝，等.不同菌株固態(tài)發(fā)酵廢白酒糟生產(chǎn)飼料蛋白的研究［J］.重慶環(huán)境科學(xué)，2003，11（25）：63－65.

［2］陸步詩，李新社.曲酒丟糟培養(yǎng)白地霉生產(chǎn)飼料的研究［J］.資源開發(fā)與利用，2006（04）：60－61.

［3］劉 軍，牛廣杰，孫東偉.混合菌種協(xié)同發(fā)酵酒糟生產(chǎn)菌體飼料蛋白的研究［J］.釀酒科技，2009（09）：116－118.

［4］汪善鋒，陳安國(guó).白酒糟資源的開發(fā)利用途徑［J］.飼料工業(yè)，2003，24（05）：43－46.

［5］孫東偉，劉 軍，牛廣杰.多菌種固態(tài)發(fā)酵酒糟生產(chǎn)菌體飼料蛋白的研究［J］.中國(guó)飼料，2010（07）：38－39.

［6］沈 萍，陳向東.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn).北京：高等教育出版社，2007：85－88.

［7］梁 峰，劉秀花，馬原松.發(fā)酵白酒糟生產(chǎn)飼料蛋白工藝研究（一）——發(fā)酵條件單因子分析［J］.商丘師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，16（06）：84－88.

［8］莫 凱，張麗鶯，張文學(xué)，等.白酒丟糟糖化降解液的制備條件探討［J］.釀酒科技，2007（10）：85－87.

［9］孫丙升，孫莉莉，劉天明，等.白地霉的應(yīng)用進(jìn)展［J］.食品開發(fā)與研究.2008（09）：163－166.

［10］侯國(guó)亮，賈 崢，趙守賢.利用酒糟生產(chǎn)酶制劑的試驗(yàn)研究［J］.中國(guó)飼料，1999（03）：28－29.

［11］邱立友.固態(tài)發(fā)酵工程原理及應(yīng)用［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2008：26－26.