劉保生，種寶紅，李志云，曹世娜

（河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002）

鋱-洛美沙星稀土敏化熒光增強(qiáng)法測定諾氟沙星

劉保生，種寶紅，李志云，曹世娜

（河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002）

采用稀土敏化熒光增強(qiáng)法，對諾氟沙星的含量進(jìn)行了測定.研究表明，在pH 6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，洛美沙星能夠與Tb3＋結(jié)合發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移.其最佳激發(fā)、發(fā)射波長分別為λex＝320nm，λem＝545nm.在該體系中加入諾氟沙星，可使其熒光進(jìn)一步增強(qiáng)，據(jù)此建立了測定諾氟沙星含量的新方法.結(jié)果表明：該方法測定諾氟沙星含量的線性為4.0×10－8～1.0×10－6mol／L；方法檢出限為8.4×10－9mol／L.將該方法用于諾氟沙星膠囊及尿樣中諾氟沙星含量的測定，平行6次測定相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.50%～4.69%和2.52%～4.40%；回收率分別為94.5%～105.6%和91.2%～96.5%，結(jié)果滿意.

鋱；洛美沙星；諾氟沙星；稀土敏化熒光增強(qiáng)法

鑭系離子具有特殊的4f電子結(jié)構(gòu)，能夠與喹諾酮類藥物結(jié)合形成m＊→m發(fā)光配合物，發(fā)射鑭系稀土離子強(qiáng)的特征熒光，即所謂的稀土敏化熒光.該熒光具有Stokes位移大、譜線窄、壽命長、背景干擾小等特點(diǎn)［1］.已報(bào)道的方法通常是利用敏化熒光的猝滅進(jìn)行其他物質(zhì)的測定，而本方法是利用敏化熒光的再增強(qiáng)進(jìn)行其他物質(zhì)的測定.

諾氟沙星（norfloxancin，NFLX），亦稱氟哌酸，是第3代喹諾酮類抗生素，具有抗菌譜廣、作用強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［2］.其含量測定方法有高效液相色譜法［3］、紫外分光光度法［4］、電化學(xué)分析法［5］、熒光法［6］等.高效液相色譜法設(shè)備成本高，試劑用量大，檢測費(fèi)時(shí)、費(fèi)力.紫外分光光度法靈敏度較低，不利于痕量測定.熒光光度法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡便等優(yōu)點(diǎn).本實(shí)驗(yàn)以洛美沙星-Tb3＋作為熒光探針，建立了NFLX含量測定的新方法，可不經(jīng)分離直接用于尿樣及膠囊樣品中諾氟沙星含量的測定，對稀土的研究及其在分析中的應(yīng)用有一定的拓展作用.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

日本島津RF-5301PC熒光分光光度計(jì)；上海雷磁分析儀器廠pHS-3C型酸度計(jì)；洛美沙星（LMX，中國藥品生物制品檢定所）溶液：1.0×10－3mol／L，用時(shí)稀釋成1.0×10－5mol／L工作液.諾氟沙星（中國藥品生物制品檢定所）溶液：8.0×10－4mol／L，使用時(shí)稀釋為4.0×10－6mol／L.氧化鋱（Tb4O7，＞99.9%）配制Tb3＋溶液［7］：準(zhǔn)確稱取0.748 1g Tb4O7固體于小燒杯中，加入少量體積比1∶1濃鹽酸，加熱至溶解，然后將溶液蒸發(fā)至近干，自然冷卻至產(chǎn)生結(jié)晶，以水溶解并定容至100mL容量瓶中，配成4.0×10－2mol／L的Tb3＋儲備液，使用時(shí)將其稀釋為4.0×10－3mol／L.以上藥品均于4℃避光保存.醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（0.1mol／L HAc及NaAc混合而成），實(shí)驗(yàn)用水為二次石英蒸餾水，所用藥品為分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

于10mL比色管中，依次加入一定量pH為6.0的HAC-NaAc緩沖溶液，1.0×10－5mol／L洛美沙星工作液，4.0×10－3mol／L Tb3＋溶液，4.0×10－6mol／L諾氟沙星溶液，用水定容，搖勻靜置20min，在入射和出射狹縫均為5nm，λex＝320nm，λem＝545nm處，用1cm比色池測定熒光強(qiáng)度或掃描光譜圖，同時(shí)做相應(yīng)的試劑空白.

2 結(jié)果與討論

2.1 洛美沙星-鋱-諾氟沙星體系的熒光光譜

體系的熒光光譜見圖1.表明：Tb3＋單獨(dú)存在時(shí)熒光極弱，Tb3＋與LMX反應(yīng)在489，545，584，622nm處出現(xiàn)Tb3＋特征發(fā)射峰，其中較強(qiáng)峰在489nm（5D4→7F6躍遷）和545nm（5D4→7F5躍遷）；584nm（5D4→7F4躍遷）和622nm（5D4→7F3躍遷）［8］處的峰熒光強(qiáng)度較弱.同時(shí)LMX 435nm的熒光強(qiáng)度大幅度降低，由此可知，LMX將自身的能量有效傳遞給Tb3＋，進(jìn)而敏化Tb3＋的熒光，與Tb3＋水合離子相比較極大地提高了Tb3＋的發(fā)光強(qiáng)度，即發(fā)生了稀土敏化熒光.同時(shí)在LMX-Tb3＋中加入NFLX，體系的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步升高.據(jù)此可以建立以LMX-Tb3＋稀土敏化熒光體系為熒光探針的測定痕量NFLX的新方法.Tb3＋離子本身的激發(fā)波長在270～290nm之間，為了避免對Tb3＋的激發(fā)，將絡(luò)合物的激發(fā)波長選擇為LMX的最佳激發(fā)波長320nm，以Tb3熒光最強(qiáng)處的發(fā)射波長545nm為熒光測定波長.

2.2 酸度的影響

喹諾酮類藥物分子中含有3-羧基-4-氧喹諾酮環(huán)系及哌嗪取代基，使得分子中的氮原子與氧原子在不同pH溶液中的質(zhì)子化程度不同，這直接影響分子電子云分布.在堿性溶液中，Tb3＋易水解生成鋱的氫氧化物沉淀，在強(qiáng)酸性溶液中，由于－COOH不易電離而難以形成絡(luò)合物［9］.在近中性環(huán)境中，喹諾酮類藥物主要以兩性離子形式存在.因此本實(shí)驗(yàn)在弱酸性條件下考察pH值對體系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果見圖2.圖2表明：pH在5.6～6.22時(shí)體系的熒光強(qiáng)度最大并保持穩(wěn)定.本實(shí)驗(yàn)選取pH為6.0作為體系反應(yīng)的最佳酸度.

圖1 體系熒光光譜Fig.1 Emission spectra

圖2 緩沖溶液酸度對體系的影響Fig.2 Effect of buffer solution acidity on the system

2.3 緩沖溶液用量的影響

固定pH為6.0，實(shí)驗(yàn)了不同緩沖體系Tris-HCl，HAc-NaAc，NaH2PO4－Na2HPO4中Tb3＋與LMX及NFLX的反應(yīng)情況，發(fā)現(xiàn)磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液中因所含的PO3－4使Tb3＋產(chǎn)生沉淀，且在醋酸-醋酸鈉Tb3＋與LMX及NFLX的能量轉(zhuǎn)移效果最好，適宜用量為0.5～1.5mL（圖3）.故本實(shí)驗(yàn)選用pH＝6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液0.8mL.

圖3 HAc-NaAc緩沖溶液用量對體系的影響Fig.3 Effect of buffer solution's volume on the system

2.4 洛美沙星、Tb3＋用量的影響

固定LMX濃度為1.0×10－6mol／L，NFLX濃度為4.0×10－7mol／L，改變Tb3＋濃度，考察Tb3＋濃度對體系熒光強(qiáng)度的影響.結(jié)果表明，隨著Tb3＋濃度增加，Tb3＋的特征熒光強(qiáng)度增大，而435nm處LMX的熒光強(qiáng)度減小.當(dāng)［Tb3＋］／［LMX］≥200時(shí)，體系熒光強(qiáng)度趨于恒定.本實(shí)驗(yàn)采用4.0×10－3mol／L Tb3＋溶液，用量為1.0mL.

固定NFLX濃度為4.0×10－7mol／L，Tb3＋濃度為4.0×10－4mol／L，改變LMX用量實(shí)驗(yàn)其對體系熒光強(qiáng)度的影響.結(jié)果表明：當(dāng)LMX用量為8×10－7mol／L～1.5×10－6mol／L體系的熒光強(qiáng)度趨于恒定.本實(shí)驗(yàn)采用1.0×10－5mol／L LMX溶液最佳用量為1.0mL.

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按實(shí)驗(yàn)方法配制溶液，當(dāng)溶液放置15min之后體系的熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定，且在2h內(nèi)基本保持不變.表明：體系熒光強(qiáng)度受溶液放置時(shí)間影響較小，實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)20min進(jìn)行測定.

2.6 干擾實(shí)驗(yàn)

當(dāng)NFLX濃度為4.0×10－7mol／L時(shí)，體系熒光強(qiáng)度的變化不超過±5%時(shí)考察外來物質(zhì)的干擾情況.結(jié)果表明：5 000倍的K＋，Na＋，Zn2＋，Pb2＋；1 000倍的NH＋4，淀粉；500倍的Fe3＋，Al3＋，Ca2＋，Mg2＋，Ba2＋，糊精；100倍的葡萄糖，但其他喹諾酮類藥物的存在對本實(shí)驗(yàn)干擾嚴(yán)重.

2.7 工作曲線與檢出限

按實(shí)驗(yàn)方法操作，改變NFLX標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量.NFLX溶液濃度在4.0×10－8～1.0×10－6mol／L內(nèi)與熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系.其線性回歸方程為ΔF＝4.71×108c＋126.48，相關(guān)系數(shù)r＝0.999 7.按3σ／K的方法求得該方法的檢出限為8.4×10－9mol／L（n＝11）.將本方法與目前檢測NFLX的光度法對比，見表1，可知本方法靈敏度較高.

表1 文獻(xiàn)報(bào)道光度法測定諾氟沙星的方法Tab.1 Comparison with the determination methods of norfloxacin

2.8 樣品分析

2.8.1 尿樣中諾氟沙星含量的測定

鑒于口服NFLX后有相當(dāng)一部分的藥物隨尿液排出，因此測定尿液中的NFLX含量，對NFLX的藥代動(dòng)力學(xué)及藥效學(xué)研究具有重要意義.用移液管取不同人的新鮮尿液各10.0mL于100mL容量瓶中定容，準(zhǔn)確量取一定量的該尿液按實(shí)驗(yàn)方法測定NFLX含量，結(jié)果為未檢出.進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2.表明：本方法可不經(jīng)分離直接用于尿液中NFLX含量的測定，結(jié)果滿意.2.8.2 諾氟沙星膠囊中諾氟沙星含量的測定

表2 尿液中諾氟沙星含量及其回收率測定結(jié)果（n＝6）Tab.2 Urine sample determination result and returns-ratio（n＝6）

取不同批號或不同廠家的諾氟沙星膠囊各1粒研磨均勻，加入適量0.1mol／L醋酸使之溶解，并分別轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中定容.靜置一段時(shí)間后取上清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，移取一定量的該溶液，按實(shí)驗(yàn)方法測定NFLX含量，并測定方法回收率，測定結(jié)果見表3.表明：本方法可不經(jīng)分離直接用于膠囊中NFLX含量的測定，測定結(jié)果顯示所測藥品的有效成分含量均符合中華人民共和國藥典規(guī)定的含量范圍.

表3 諾氟沙星膠囊中諾氟沙星含量及其回收率測定結(jié)果（n＝6）Tab.3 Capsule sample determination result and returns-ratio（n＝6）

3 結(jié)論

利用稀土敏化熒光技術(shù)，建立了熒光光度法測定制劑和尿液中諾氟沙星含量的新方法，由于稀土熒光Stokes位移大、譜線窄、穩(wěn)定、背景干擾小等特點(diǎn)，使得該方法靈敏度高，選擇性好，重現(xiàn)性好.該研究進(jìn)一步發(fā)展了稀土元素在熒光分析中的應(yīng)用.

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（責(zé)任編輯：梁俊紅）

Application of terbium-lomefloxacin sensitized fluorescence for the determination of norfloxacin

LIU Baosheng，ZHONG Baohong，LI Zhiyun，CAO Shina
（College of Chemistry and Environmental Science，Hebei University，Baoding 071002，China）

A simple，rapid and sensitive spectrofluorimetric method for the determination of fluoroquinolone antibiotics，norfloxacin，is described.This method makes use of the radiative energy transfer from fluoroquinolones to terbium ions in weakly acidic solution.In the acetic acid-sodium acetate buffer solution of pH＝6.0，terbium（Tb3＋）and lomefloxacin react and combine as steady complex under room temperature.The Tb3＋-lomefloxacin complex enhance the characteristic fluorescence of the Tb3＋.The maximum excitation wavelength and maximum emission wavelength is atλex＝320nm andλem＝545nm，respectively.The fluorescence intensity increased with norfloxacin added，while the locations of the excitation and emission wavelengths stayed the same.According to this，a new way to determine the concentration of norfloxacin was established.Optimum conditions for the formation of the complexes were investigated.The concentration of norfloxacin presented a nice liner relation with the fluorescence intensity under the range from 4.0×10－8mol／L to 1.0×10－6mol／L.Under optimum conditions，the detection limit of the method was up to 8.4×10－9mol／L.This method was successfully applied to determine norfloxacin in capsule and urine.The relative standard deviation was 2.50%—4.69%and 2.52%—4.40%for 6parallel determinations of norfloxacin samples and the recoveres were 94.5%—105.6%and 91.2%—96.5%，respectively.It can be used directly for the determination of norfloxacin in urine and capsules without isola-tion.There is certain guiding significance for the expansion of the research about the application of rare earth elements in the fluorescence analysis.

terbium；lomefloxacin；norfloxacin；rare earth-sensitized fluorescence enhancement

劉保生（1963-），男，河北保定人，河北大學(xué)研究員，主要從事分子發(fā)光理論與應(yīng)用研究.E-mail：lbs＠hbu.edu.cn

O657.3

A

1000 1565（2014）05 0485 06

10.3969／j.issn.1000 -1565.2014.05.008

2014-03 -12

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（206275024）；河北省重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（10967126D）.