陳力玉　張淑卿　李劍峰　等

摘要：將含有cfp（cyan fluorescent protein）基因質(zhì)粒的熒光標(biāo)記根瘤菌S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28，S.12531cfp2、S.12531cfp13、S.12531cfp26、S.LH3436cfp1、S.LH3436cfp2、S.LH3436cfp6接種于甘農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿，測(cè)定苜蓿幼苗生物量、單株結(jié)瘤數(shù)、固氮酶活性等，結(jié)果表明：熒光標(biāo)記根瘤菌可有效促進(jìn)植株生長(zhǎng)和生物量的積累，有明顯促生效果；與出發(fā)菌相比，熒光標(biāo)記根瘤菌未對(duì)苜蓿幼苗產(chǎn)生顯著的不良影響，能在植物體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，具有與出發(fā)菌株相近的促生能力。

關(guān)鍵詞：根瘤菌；接種；苜蓿幼苗；生物量；固氮酶活性

中圖分類(lèi)號(hào)：S 154.37；S 54文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：10095500（2013）06000108

固氮效率由根瘤菌和豆科植物雙方的基因所控制，豆科植物相關(guān)基因與根瘤菌相關(guān)基因的相容性決定了根瘤菌侵染豆科植物的有效性[1]。接種根瘤菌釋放至田間后，必然要與土著根瘤菌及種子內(nèi)生根瘤菌[2]在土壤營(yíng)養(yǎng)、生活空間及宿主植物等方面進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，接種根瘤菌能否正常結(jié)瘤直接取決于其競(jìng)爭(zhēng)力的大小。

目前，對(duì)于cfp基因用于苜蓿根瘤菌的研究較少，為檢測(cè)cfp基因標(biāo)記后的根瘤菌能否侵染植物根系并結(jié)瘤，將含有cfp基因的質(zhì)粒的熒光標(biāo)記根瘤菌S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28，S.12531cfp2、S.12531cfp13、S.12531cfp26、S.LH3436cfp1、S.LH3436cfp2、S.LH3436cfp6接種于甘農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿（Medicago sativa cv.Gannong No.5），以不接種的處理為對(duì)照，觀(guān)察導(dǎo)入的cfp基因在植物體內(nèi)能否正常表達(dá)，比較出發(fā)菌S.LZgn5、S.12531和S.LH3436及其cfp熒光標(biāo)記菌對(duì)苜蓿幼苗的影響。

1材料和方法

1.1供試種子

甘農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿種子，由草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

試驗(yàn)培養(yǎng)基為T(mén)Y培養(yǎng)基[3]，酵母甘露醇液體培養(yǎng)基[4]和Hoagland無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液[5]。

1.2菌株

出發(fā)菌S.LZgn5及其熒光標(biāo)記菌S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28，出發(fā)菌S.12531及其熒光標(biāo)記菌S.12531cfp2、S.12531cfp13、S.12531cfp26。

出發(fā)菌S.LH3436及其熒光標(biāo)記菌S.LH3436cfp1、S.LH3436cfp2、S.LH3436cfp6。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1種子表面滅菌

取適量甘農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿種子，置于已滅菌的三角瓶，用無(wú)菌水洗滌2次，加入75%的乙醇浸泡3 min，無(wú)菌水清洗4次，每次2 min，0.1%的HgCl2浸泡3 min，無(wú)菌水清洗4次，每次2 min。將表面滅菌的種子置于YMA培養(yǎng)基，觀(guān)察是否有菌長(zhǎng)出，檢測(cè)表面滅菌是否徹底。

1.3.2苜蓿種子的發(fā)芽處理

將培養(yǎng)皿和濾紙121 ℃滅菌26 min，然后在無(wú)菌培養(yǎng)皿中放入雙層無(wú)菌濾紙[6]，將表面滅菌的甘農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿種子均勻置于

1.3.3制備菌液及接種

將苜蓿根瘤菌及其熒光標(biāo)記菌，分別轉(zhuǎn)接到裝有100 mLYMA液體培養(yǎng)基的三角瓶，將三角瓶置于搖床，28 ℃，120 rmin培養(yǎng)至在OD600 nm的吸光度達(dá)到0.5～0.8。

1.4測(cè)定指標(biāo)和方法

1.4.1生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

在苜蓿苗生長(zhǎng)的第46 d，將苜蓿苗和河砂從杯中整體取出，用水沖洗，至苜蓿苗根系完全沖洗干凈，在水中將苜蓿苗根系分開(kāi)，盡量保持根的完整性，用濾紙吸干植株表面水分。

（1）測(cè)量苜蓿苗的株高及根長(zhǎng)。

（2）對(duì)各處理的葉片數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

（3）選取植株自上而下倒數(shù)第2個(gè)分枝中間的葉片，采用描形稱(chēng)重法[8]測(cè)定葉片的葉面積，每處理3次重復(fù)。

（4）稱(chēng)量地上鮮重、根鮮重，每處理3次重復(fù)，稱(chēng)鮮重后置于烘箱中，105 ℃處理20 min，80 ℃連續(xù)烘干12 h后稱(chēng)其干重。

1.4.2固氮能力測(cè)定

（1）單株結(jié)瘤數(shù)采用苜蓿苗根瘤計(jì)數(shù)。

（2）根瘤等級(jí)的劃分[9]采用5分制：1分根瘤為中空無(wú)內(nèi)容物的死亡根瘤；2分根瘤為切面灰白色的無(wú)效根瘤；3分根瘤切面略呈粉紅色，但直徑小于<0.5 mm；4分根瘤切面呈粉紅色，1 mm>直徑≥0.5 mm；5分根瘤切面呈粉紅色，直徑≥1 mm。

（3）根瘤固氮酶活性的測(cè)定：各回接植株根瘤的固氮酶活性采用乙炔還原法[10]。在根瘤兩端根系0.5 cm處，將根瘤切下，稱(chēng)其鮮重0.1 g，置于盛有濕潤(rùn)濾紙片的17 mL西林瓶中，蓋緊瓶塞，并以保鮮膜密封，每處理3次重復(fù)，以2 mL的無(wú)菌注射器抽出1.7 mL的瓶?jī)?nèi)空氣，再注入1.7 mL乙炔氣體，其終濃度為10%。室溫下反應(yīng)1 h后，以100 μL進(jìn)樣器抽取西林瓶?jī)?nèi)氣體50 μL，用GC7890F氣相色譜儀測(cè)定各處理在1 h內(nèi)生成的乙烯氣體含量（μmol），計(jì)算植株根瘤的固氮酶活性，（μmolh·g）[11]。

（4）熒光標(biāo)記菌占瘤率的檢測(cè)選取各處理植株生長(zhǎng)良好的根瘤，從根瘤兩端根系0.5 cm處將根瘤切下[12]，各稱(chēng)取0.01 g，用無(wú)菌水沖洗2次，再以75%的乙醇處理5～10 s，破除表面張力，去除組織上的氣泡，無(wú)菌水沖洗4次；以碘伏浸泡2 min，用無(wú)菌水沖洗干凈；將根瘤轉(zhuǎn)移至無(wú)菌研缽中，加入4 mL無(wú)菌水研磨充分后轉(zhuǎn)移至5 mL無(wú)菌離心管中，5 000 rmin離心5 min；再吸取0.2 mL上清液涂抹于TY平板，每處理3次重復(fù)，待菌落長(zhǎng)出后，以手提式紫外燈（OD336 nm）照射，計(jì)數(shù)并拍照。

1.4.3葉綠素含量測(cè)定[13]

取各處理長(zhǎng)勢(shì)相似植株至上而下第二個(gè)分枝的苜蓿葉片，各稱(chēng)取0.1 g剪碎，測(cè)定葉綠素含量。

以Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用IBM16.0 SPSS分析軟件以Duncan法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1熒光標(biāo)記菌及其出發(fā)菌株對(duì)苜蓿幼苗生物量的影響

生物量的大小反映了植株積累物質(zhì)能力的強(qiáng)弱，接種的苜蓿幼苗的根鮮重和干重、地上部分鮮重和干重均高于未接種的處理。其中，進(jìn)行S.LZgn5，S.LZgn5cfp6，S.LZgn5cfp16和S.LZgn5cfp28接種的苜蓿幼苗的根鮮重高出對(duì)照163.8%～208.4%，根干重高出對(duì)照167.9%～225.9%，地上鮮重高出對(duì)照76.4%～107.2%，地上干重高出對(duì)照88.9%～99.7%，均與對(duì)照差異顯著（P<0.05），表明S.LZgn5及其熒光標(biāo)記菌具有一定的促生作用。

S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28接種后苜蓿幼苗的根鮮重、根干重、地上鮮重和干重分別比出發(fā)菌S.LZgn5高出3.2%～16.9%、4.6%～21.6%、3.2%～17.5%和2.4%～5.7%，但差異均不顯著（P<0.05），說(shuō)明S.LZgn5的熒光標(biāo)記菌的接種并沒(méi)有影響苜蓿幼苗生物量的積累，而是促進(jìn)了生物量的增加，以S.LZgn5cfp6表現(xiàn)較好。

S.12531及其熒光標(biāo)記菌的接種提高了苜蓿幼苗生物量；其中，根鮮重、根干重、地上鮮重和干重

2.2熒光標(biāo)記菌及其出發(fā)菌株對(duì)苜蓿幼苗根長(zhǎng)、株高等的影響

2.3熒光標(biāo)記菌及其出發(fā)菌株對(duì)苜蓿幼苗固氮能力的影響

苜蓿根瘤的固氮酶活性大小反映了根瘤中根瘤菌固定氮素能力的強(qiáng)弱，能否在原寄主上形成有效根瘤是確認(rèn)根瘤菌是否有效的基本方法。S.LZgn5及其熒光標(biāo)記菌S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28接種的苜蓿幼苗的單株結(jié)瘤數(shù)、根瘤固氮酶活性和根瘤等級(jí)均與對(duì)照存在顯著差異（P<0.05），其中，固氮酶活性是對(duì)照的12.4～14.4倍，可見(jiàn)，根瘤菌S.LZgn5及其熒光標(biāo)記菌的接種提高了根瘤的固氮酶活性，S.LZgn5cfp6較好。

S.LZgn5cfp6，S.LZgn5cfp16和S.LZgn5cfp28接種的苜蓿幼苗的單株結(jié)瘤數(shù)、固氮酶活性及根瘤等級(jí)比出發(fā)菌S.LZgn5高出15.7%，5.1%和6.2%，無(wú)顯著差異（P>0.05）；熒光標(biāo)記菌的占瘤率與50%相比，無(wú)顯著差異，說(shuō)明熒光標(biāo)記菌具有一定的與種子內(nèi)生根瘤菌競(jìng)爭(zhēng)的能力。

2.4熒光標(biāo)記菌及其出發(fā)菌株對(duì)苜蓿幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素含量的高低反應(yīng)了植物光合作用的強(qiáng)弱，也間接體現(xiàn)了植株利用氮素能力的強(qiáng)弱。S.LZgn5及其熒光標(biāo)記菌S.LZgn5cfp6、S.LZgn5cfp16、S.LZgn5cfp28接種的苜蓿幼苗的葉片葉綠素含量比對(duì)照高出52.3%～67.1%（圖1），差異顯著（P<0.05），各熒光標(biāo)記根瘤菌與出發(fā)菌相比，無(wú)顯著差異。

S.12531及其熒光標(biāo)記菌S.12531cfp2、S.12531cfp13、S.12531cfp26接種的苜蓿幼苗的葉片葉綠素含量比對(duì)照高出57.7%～63.7%（圖2），差異顯著（P<0.05），而各熒光標(biāo)記根瘤菌與出發(fā)菌相比，無(wú)顯著差異。

3討論

根瘤菌為微好氧[15]的革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，能與植物共生，固定氮素供給宿主營(yíng)養(yǎng)。有研究表明，根瘤菌的接種可顯著提高植物產(chǎn)量。目前，美國(guó)有80%的苜蓿在播種之前進(jìn)行根瘤菌接種，加拿大和澳大利亞幾乎所有苜蓿在播種之前都要進(jìn)行根瘤菌接種，我國(guó)從1981年開(kāi)始進(jìn)行苜蓿根瘤菌優(yōu)良菌株的篩選。研究中，各出發(fā)菌與其熒光標(biāo)記菌接種苜蓿幼苗的地上鮮重和干重、根鮮重和干重、根長(zhǎng)、株高和固氮酶活性等均顯著（P<0.05）高于未接種的處理，說(shuō)明出發(fā)菌與其熒光標(biāo)記菌均具有明顯的促生作用，且熒光標(biāo)記根瘤菌不會(huì)對(duì)苜蓿幼苗的根系產(chǎn)生影響。

試驗(yàn)中，無(wú)菌環(huán)境下表面消毒的苜蓿種子仍可結(jié)瘤，且各熒光標(biāo)記菌接種于苜蓿幼苗后，占瘤率并未達(dá)到100%，說(shuō)明在熒光標(biāo)記菌接種的苜蓿幼苗根瘤中有其他根瘤菌的存在，這也印證了張淑卿的推論[2]，即苜蓿種子內(nèi)部攜帶有根瘤菌，同時(shí)在苜蓿種子發(fā)芽過(guò)程中，種皮吸水膨脹，其攜帶的根瘤菌隨種皮浸出液分布于胚根根際的土壤，完成種子內(nèi)生根瘤菌的接種；熒光質(zhì)粒的復(fù)制需借助于根瘤菌細(xì)胞產(chǎn)生的能量，而根瘤菌侵染植株根系和結(jié)瘤固氮又是高耗能的生理過(guò)程，因此，根瘤菌細(xì)胞和其熒光質(zhì)粒間正常和諧的運(yùn)作是熒光標(biāo)記根瘤菌能否成功侵染根系的重要方面，在進(jìn)入植株根系后，熒光標(biāo)記根瘤菌必然要與種帶根瘤菌競(jìng)爭(zhēng)生存空間和養(yǎng)分供給，能否在植株根系形成有效根瘤決定于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力的大小[16，17]。

試驗(yàn)研究中，在各熒光標(biāo)記根瘤菌回接的苜蓿幼苗的根瘤中，均檢測(cè)出熒光標(biāo)記根瘤菌，S.LZgn5和S.LH3436的熒光標(biāo)記根瘤菌的占瘤率與50%相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明熒光標(biāo)記根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力與種子內(nèi)生根瘤菌相當(dāng)，熒光質(zhì)粒的導(dǎo)入沒(méi)有顯著影響根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力；S.12531的熒光標(biāo)記根瘤菌的占瘤率均高于50%，與50%相比[14]差異顯著（P<0.05），說(shuō)明各熒光標(biāo)記根瘤菌均能成功侵染和結(jié)瘤，表明熒光質(zhì)粒的導(dǎo)入并未對(duì)菌株的侵染和結(jié)瘤能力有顯著的負(fù)面影響。

導(dǎo)入外源質(zhì)粒的標(biāo)記菌對(duì)宿主的侵染結(jié)瘤及促生能力與菌種自身的性質(zhì)、宿主植物的種類(lèi)與質(zhì)粒類(lèi)型相關(guān)[19，20]。李杰[18]等運(yùn)用三親本雜交法將帶有l(wèi)uxAB和parCBA基因的重組質(zhì)粒pHN208導(dǎo)入到6株大豆根瘤菌中，通過(guò)接種試驗(yàn)證明PHN208的導(dǎo)入并不影響根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力。本研究通過(guò)S.LZgn5、S.LH3436和S.12531的熒光標(biāo)記根瘤菌的接種試驗(yàn)，測(cè)定接種苜蓿幼苗的生物量、固氮能力指標(biāo)和葉片葉綠素含量等指標(biāo)，結(jié)果顯示外源質(zhì)粒的導(dǎo)入未影響標(biāo)記菌的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力。

4結(jié)論

4.1熒光標(biāo)記菌根瘤菌的促生作用

S.LZgn5，S.12531和S.LH3436及其熒光標(biāo)記菌根瘤菌接種苜蓿幼苗的根鮮重和干重、地上部分鮮重和干重、根瘤固氮酶活性、根長(zhǎng)、株高和葉綠素含量等均顯著（P<0.05）高于未接種的處理。這說(shuō)明接種本研究涉及的含熒光質(zhì)粒的根瘤菌可有效促進(jìn)植株的生長(zhǎng)和生物量的積累，具有明顯的促生效果。

4.2熒光標(biāo)記根瘤菌與出發(fā)菌接種效果的比較

（1）各熒光標(biāo)記根瘤菌接種苜蓿幼苗的根鮮重和干重、地上部分鮮重和干重、株高和根長(zhǎng)等與對(duì)應(yīng)的出發(fā)菌相比，無(wú)顯著差異。表明熒光質(zhì)粒的導(dǎo)入沒(méi)有影響菌株對(duì)苜蓿幼苗生物量積累的促進(jìn)效果。

（2）在固氮能力指標(biāo)中，各熒光標(biāo)記根瘤菌與其對(duì)應(yīng)的出發(fā)菌在接種的苜蓿幼苗的單株結(jié)瘤數(shù)、根瘤固氮酶活性、根瘤等級(jí)評(píng)分和占瘤率方面的表現(xiàn)有差異。

S.12531cfp13接種苜蓿幼苗的根瘤固氮酶活性比S.12531高出42.9%，差異顯著（P<0.05）；且各熒光標(biāo)記根瘤菌的占瘤率均高于50%，差異顯著（P<0.05）。

S.LH3436cfp1、S.LH3436cfp2、S.LH3436cfp6接種的苜蓿幼苗的根瘤數(shù)均低于出發(fā)菌株S.LH3436，差異顯著（P<0.05），S.LH3436cfp6接種的苜蓿幼苗的根瘤固氮酶活性和根瘤等級(jí)評(píng)分要高于出發(fā)菌S.LH3436，差異顯著（P<0.05）。

參考文獻(xiàn)：

[1]Tan G Y.Genetic variation for acetylene reduction rate and other character in alfalfa[J].Crop Science，1981，21：485-488.

[2]張虎天，郭麗琢，柴強(qiáng)，等.接種根瘤菌對(duì)豌豆玉米體系根際細(xì)菌數(shù)量及氮營(yíng)養(yǎng)的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46（1）：30-33.

[3]張忠明，陳華癸，李阜棣，等.紫云英根瘤菌基因文庫(kù)的構(gòu)建及含完整結(jié)瘤基因的重組質(zhì)粒pRaZ15的分離[J].生物工程學(xué)報(bào)，1991，7（3）：213-219.

[4]殷愛(ài)華，韓素芬.豆科樹(shù)種凝集素和根瘤菌胞外多糖結(jié)合反應(yīng)與結(jié)瘤的關(guān)系[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，29（5）：88-90.

[5]Hoagland D，Arnon D I.The water culture method for growing plants without soil[J].California Agricultural Experiment Station Bulletin，1938（1）：1-39.

[6]Vertucci C W，Roosee，Crane J.The oretical basis of protocols foe seed storage optimummoisture contents for pea seeds stored at different temperatures[J].Annalsof Botany，1994，74：531-540.

[7]Shi D C，Zhao K F.Effects of sodium chloride and carbonate on growth of puccinellia tunuiflora and on present state of mineral elements in nutrient solution[J].Acta Pratacult，1997，6：51-61.

[8]譚一波.葉面積指數(shù)的主要測(cè)定方法[J].林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2008，33（3）：47-49.

[9]李劍峰，師尚禮，張淑卿.環(huán)境酸度對(duì)紫花苜蓿早期生長(zhǎng)和生理的影響[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（2）：47-54.

[10]HaraS，HashidokoY，DesyatkinR V，et al.High rate of N2 fixation by east Siberian cryophilic soil bacteria as determined by measuring acetylene reduction in nitrogen poor medium solidified with gellan gum [J].Applied and Environmental Microbiology，2009，75：2811-2819.

[11]譚志遠(yuǎn)，彭桂香，徐培智，等.普通野生稻（Oryza rufipogen）內(nèi)生固氮菌多樣性及高固氮酶活性[J].科學(xué)通報(bào)，2009，54：1885-1893.

[12]Somasegaran P，Hoben H J.Methods in legumerhizobium technology [M].1985：7-29

[13]鄒琦.植物生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1995.

[14]凌瑤，張小平，周俊初，等.用熒光酶基因（cfp）標(biāo)記法研究菜豆根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)性和有效性[J].中國(guó)土壤與肥料，2008（1）：73-77.

[15]霍爾特（著）.劉復(fù)今（譯）.伯杰鑒定手冊(cè)[M]（第八版）.濟(jì)南：山東大學(xué)出版社，1988：93- 94.

[16]陳翠翠，馬元武，馮永君，等.MADSbox家族蛋白在植物開(kāi)花、結(jié)實(shí)及根瘤形成中的多功能調(diào)節(jié)作用[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（2）：80-83.

[17]Dudeja S S.Persistence of Dradyrhizobium S P.（caianus） in a sandy loam[J].Soil Boil Biochem，1989，21（5）：709-713.

[18]李杰，陳麗華，李希臣.一種應(yīng)用luxAB基因標(biāo)記大豆根瘤菌的新方法[J].大豆科學(xué)，2003，22（3）：172-175.

[19]李友國(guó)，周俊初.導(dǎo)入dctABD和nifA基因?qū)M(fèi)氏中華根瘤菌共生固氮的影響研究[J].遺傳學(xué)報(bào)，2002，29（2）：181-188.

[20]朱光富，周俊初，陳華癸.外源質(zhì)粒（基因）導(dǎo)入花生根瘤菌的行為分析[J].遺傳學(xué)報(bào)，1996，23（2）：131-141.