李建飛，王俊麗，公維鎮(zhèn)，費良丹，劉金豆

（中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081）

銀蓮花（Anemonecathayensis）為毛茛科（Ranunculaceae）銀蓮花屬（Anemone）植物，在我國分布于山西、河北等地，海拔高度為1 000～1 600m，主要生長于山坡草地、山谷溝邊或多石礫坡地.朝鮮也有分布［1］.銀蓮花屬許多植物為中國傳統(tǒng)中藥材，在民間人們將阿爾泰銀蓮花、西南銀蓮花、多被銀蓮花、鵝掌草、野棉花等作為消炎［2］、鎮(zhèn)痛、抗菌［3］、驅(qū)蟲等藥物使用，《中華人民共和國藥典》已將多被銀蓮花的根莖收載，用于祛風(fēng)濕、消癰腫，同時還可治療骨節(jié)疼痛、癰腫潰爛、風(fēng)寒濕痹等癥［4］.

目前，國內(nèi)對銀蓮花屬植物的生物活性研究主要集中于銀蓮花素A抗癌活性的研究［5－10］，對其抗氧化活性和抑菌活性的研究很少.本研究主要通過DPPH法研究銀蓮花乙醇提取物不同組分的抗氧化活性，通過抑菌圈法探究不同組分對金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、大腸桿菌（Esherichiacoli）和枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）抑菌活性，通過MTT法研究不同組分及分離到的3－氧－2，23－二羥基－齊敦果－12－烯－28－酸等10個不同單體化合物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用.

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

銀蓮花植株采自北京靈山海拔2 200m處陽坡.取1.5kg全草干品，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇閃式提取，合并減壓蒸干得粗提物.組分Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ分別是石油醚與丙酮體積比為5∶1，3∶1，2∶1，1∶1時和純丙酮層經(jīng)過硅膠柱梯度洗脫所得浸膏.10個單體化合物分別為3－氧－2，23－二羥基－齊敦果－12－烯－28－酸（1），28－羥基－齊敦果－12－烯－3，11－二酮（2），3－甲氧基－齊敦果－11－酮－18－烯（3），熊果酸（4），α－香樹脂醇（5），28－羥基－α－香樹脂醇（6），2α，23－二羥基－熊果酸（7），香豆素（8），4，7－二甲氧基－5－甲基香豆素（9），槲皮素－7－O－鼠李糖苷（10），其分離方法參見文獻［11］.

所用腫瘤細(xì)胞為人乳腺腫瘤細(xì)胞（MDA－MB－231）；所用菌種分別為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Esherichiacoli）和枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），均由本實驗室保藏.

1.2 方法

1.2.1 抗氧化活性測定

參照Kirby和Schmidt方法［12］.200μL反應(yīng)體系中包含：各種不同待測樣品100μL（用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶解），60μmol DPPH（SIGMA－ALDRICH，批號：S90790－379）乙醇溶液100μL.于酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）中振動搖勻，暗反應(yīng)30min后，用酶標(biāo)儀在517nm下測量吸光度（A）.維生素C作為陽性對照，對照組和處理組都重復(fù)3次.自由基清除活性的計算公式如下［13］：抑制率＝［（A對照－A樣品）／A對照］×100%.用SPSS17.0版本的相關(guān)功能計算其半數(shù)抑制濃度

1.2.2 抑菌活性的測定

1.2.2.1 菌懸液制備和培養(yǎng)基的配制

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌接種培養(yǎng)（37℃的搖床上活化培養(yǎng)24h）后，用無菌生理鹽水稀釋成含菌量為106～108／mL的菌懸液備用.

在每個直徑為90mm的培養(yǎng)皿中加入蛋白胨培養(yǎng)基約10mL，冷凝，再取0.2mL菌懸液加入到10mL 45℃左右的培養(yǎng)基中，充分混合后，倒入上述培養(yǎng)基表面，待其凝固后，用打孔器在培養(yǎng)基上打孔，孔徑為6mm.

1.2.2.2 抑菌活性的測定

分別將不同質(zhì)量濃度的組分Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ甲醇溶液各20μL加入到小孔中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察并測量抑菌圈的直徑.以注射用青霉素鈉作為陽性對照，以無菌水作為陰性對照.

1.2.3 抗腫瘤活性研究

1.2.3.1 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)

將人乳腺腫瘤細(xì)胞（MDA－MB－231）接種于含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、100u／mL青霉素、100u／mL鏈霉素雙抗RMPI－1640培養(yǎng)基上，置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h.

加入適量培養(yǎng)基，將腫瘤細(xì)胞懸液稀釋至1×105／mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL（約含1×104個細(xì)胞）.置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h.

1.2.3.2 抗腫瘤活性檢測

實驗組各孔分別加入質(zhì)量濃度為1，500，250，125，62.5μg／mL的不同組分和單體的甲醇溶液各100μL，每個劑量組重復(fù)3次；以表阿霉素（輝瑞制藥無錫有限公司）作為陽性對照，將其配制成質(zhì)量濃度為1μg／mL的溶液，每個對照孔加入20μL；以RMPI－1640完全培養(yǎng)基作為陰性對照，每組重復(fù)3次.將培養(yǎng)物置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，各培養(yǎng)孔中加入MTT 20μL，再培養(yǎng)4h，棄上清液，每孔加入DMSO 100μL，充分振蕩混合10min.通過酶標(biāo)儀檢測吸光度（OD值），檢測波長為570nm.為保證實驗不被污染，采用0.2μm無菌濾器對各種試劑進行除菌處理.

1.2.3.3 腫瘤細(xì)胞抑制率的計算

不同組分和單體化合物對腫瘤細(xì)胞抑制率按如下公式計算.抑制率（CI）＝［（空白對照組的OD值－實驗組的OD值）／空白對照組的OD值］×100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組分的抗氧化活性

2.1.1 DPPH自由基清除率

分析發(fā)現(xiàn)，各組分均有不同程度的自由基清除活性，且清除率與樣品的質(zhì)量濃度正向相關(guān)，在質(zhì)量濃度為100μg／mL時，組分Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ消除率分別為74.9%，43.3%，33.0%，55.1%和22.8%.其中組分Ⅰ的清除率最高（74.9%），組分Ⅴ清除率最低，僅有22.8%（圖1）.與陽性對照維生素C（VC）相比，各組分抗氧化活性均低于VC.

圖1 5種不同組分對DPPH自由基的消除率Fig.1 DPPH radical scavenging activities of different fractions

表1 5種不同組分的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度Tab.1 IC50Value of 5different fractionsμg·mL－1

由表1可知，組分Ⅰ的抗氧化活性最好，對DPPH自由基的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50為30.58μg／mL.各組分的IC50值由小到大依次為Ⅰ＜Ⅳ＜Ⅱ＜Ⅲ＜Ⅴ.組分的IC50值越小，表明其抗氧化能力越強，不同組分的抗氧化能力由強到弱依次為Ⅰ＞Ⅳ＞Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅴ.

2.2 抑菌活性

不同質(zhì)量濃度的5種組分對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌效果如表2.

表2 5種不同組分的抑菌活性Tab.2 Antimicrobial activities of 5different fractions

從表2可以看出，組分Ⅴ抑菌活性最強，在質(zhì)量濃度為40mg／mL時，對大腸桿菌、枯草芽抱桿菌、金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，當(dāng)質(zhì)量濃度降低到10mg／mL時對3種菌仍表現(xiàn)出抑制作用.組分Ⅲ在質(zhì)量濃度為40mg／mL時對3種菌也表現(xiàn)出明顯的抑制作用，在質(zhì)量濃度為160mg／mL時抑制性最強，金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為13mm，大腸桿菌抑菌圈直徑12mm，枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為14mm.80mg／mL的組分Ⅳ對枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出一定的抑制活性，但對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌沒有明顯的抑制作用.組分Ⅰ和組分Ⅱ抑菌活性最差，它們對3種菌的抑制作用均不明顯.

2.3 抗人乳腺腫瘤細(xì)胞活性

2.3.1 5種不同組分對腫瘤細(xì)胞的抑制率

通過分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ5種不同組分質(zhì)量濃度為100μg／mL時，對人乳腺腫瘤細(xì)胞（MDAMB－231）抑制率分別為31.79%，50.32%，37.69%，43.65%和29.47%（圖2）.表阿霉素對其抑制作用十分明顯，雖然加入量很少（20ng），但對腫瘤細(xì)胞的抑制率高達69.08%.

由圖2可以看出，各個組分對人乳腺腫瘤細(xì)胞（MDA－MB－231）均有一定的抑制作用，其抗腫瘤活性從高到低依次為Ⅱ＞Ⅳ＞Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅴ，其中組分Ⅱ的抑制活性最高，達到了50.32%.雖然這5種組分對人乳腺腫瘤細(xì)胞均有一定的抑制活性，但是與陽性對照表阿霉素相比，活性明顯偏弱.

2.3.2 不同單體化合物對腫瘤細(xì)胞的抑制率

研究發(fā)現(xiàn)，單體化合物8，9和10對人乳腺腫瘤細(xì)胞沒有明顯抑制作用，化合物1～7均有一定的抗腫瘤細(xì)胞活性.當(dāng)質(zhì)量濃度為100μg／mL時，這7種單體化合物對腫瘤細(xì)胞的抑制率分別達到26.41%，37.80%，33.17%，20.38%，18.31%，16.20%和22.48%，其中化合物2（28－羥基－齊敦果－12－烯－3，11－二酮）對腫瘤細(xì)胞的抑制活性最明顯（圖3）.

圖2 5種不同組分對MDA－MB－231腫瘤細(xì)胞的抑制率Fig.2 Inhibition activity of different fractions on human breast cancer cells

圖3 10種單體化合物對MDA－MB－231腫瘤細(xì)胞的抑制率Fig.3 Inhibition activity of different compounds extracted on human breast cancer cells

3 討論

盛俠［15］研究結(jié)果表明，齊墩果酸對DPPH自由基有一定的抑制作用，并且隨著齊墩果酸質(zhì)量濃度的增大，其對自由基的抑制率明顯提高，當(dāng)齊墩果酸為1.0mg／mL時對DPPH自由基的抑制率達到60.86%.本研究發(fā)現(xiàn)，組分I的抗氧化活性最高，其中是否為齊墩果酸類化合物起主要作用，需要進一步的研究.

蘇波［16］研究毛茛皂苷的抑菌活性時發(fā)現(xiàn)，毛茛皂苷對綠膿桿菌、糞腸球菌、產(chǎn)氣腸球菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，而對大腸桿菌、藤黃八疊球菌、枯草芽孢桿菌、副甲硫桿菌、雞沙門氏菌5種菌株沒有明顯的生長抑制性.白宇明［17］發(fā)現(xiàn)，金蓮花是一種抑菌普很廣的中草藥，其提取物在體外對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較好的抑菌活性.林晨等［18］發(fā)現(xiàn)，金蓮花不同提取物抑菌效果不同.水提物對金黃色葡萄球菌的MIC為3.0mg／mL，體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇提取物對枯草芽孢桿菌的MIC是31.3mg／mL，體積分?jǐn)?shù)為60%和90%的乙醇提取物對大腸桿菌的MIC是125.0mg／mL.本研究發(fā)現(xiàn)，組分Ⅴ和Ⅲ在質(zhì)量濃度為80mg／mL時對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有抑制作用，這進一步說明毛茛科銀蓮花屬植物可作為一種很好的抗菌資源植物.

鄭開波等［19］、張東方等［20］研究發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸對人口腔鱗癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，并且對正常細(xì)胞毒性較小.王丹丹等［21］研究結(jié)果表明，齊墩果酸及其衍生物對肺癌細(xì)胞均有抑制作用，3－氧代齊墩果酸的抑制活性最強，其抑制率高達90.0%，IC50為24.2μg／mL.本研究結(jié)果表明，齊墩果酸還對人乳腺腫瘤細(xì)胞（MDA－MB－231）具有一定的抑制作用，說明該化合物對腫瘤細(xì)胞抑制作用具有廣譜性.

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