趙燕燕，石敏健，劉麗艷，韓媛媛，李楊

（1.河北大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北保定 071000；2.河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002）

甘草是重要的傳統(tǒng)中藥，其主要活性成分為甘草酸.制藥業(yè)通常將甘草酸制成水溶性的甘草酸鹽，如甘草酸單銨鹽作為制劑生產(chǎn)的原料藥.甘草酸單銨鹽主成分是一對差向異構(gòu)體——18α－甘草酸（18α－glycyrrhizic acid，18α－Gly）和18β－甘草酸（18β－glycyrrhizinic acid，18β－Gly），并含有2個有關(guān)物質(zhì)，分別命名為雜質(zhì)A和雜質(zhì)B.18α－Gly和18β－Gly分子式相同，僅在18位H存在構(gòu)相差異，但其藥理作用、不良反應(yīng)及臨床療效方面存在顯著不同［1－5］，近年來，二者的比較研究越來越受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注.隨著國內(nèi)外對其作用機(jī)制研究的不斷深入，使得甘草酸制劑行業(yè)取得了很大的發(fā)展，甘草酸及其制劑的新藥申報日趨增多，多種劑型的甘草酸類藥物在國內(nèi)外紛紛上市，被廣泛用于治療各種急慢性肝炎、支氣管炎、艾滋病和癌癥，同時具有誘生干擾素及調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫等功效.甘草酸單銨鹽的醫(yī)藥市場前景非常廣闊.但中國藥典2010版未收載甘草酸單銨鹽原料藥或制劑；現(xiàn)行中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（WS1－XG－2002）只收載了甘草酸的相關(guān)制劑，且只對其主成分混合物進(jìn)行了含量檢測，未能實(shí)現(xiàn)對18α－Gly和18β－Gly的有效分離，也未對有關(guān)物質(zhì)檢測及限度問題作出規(guī)定，造成其內(nèi)部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的缺失，因此建立同時分離檢測甘草酸制劑主成分異構(gòu)體及其有關(guān)物質(zhì)的分析方法顯得尤為重要.

目前，甘草酸類制劑及其原料藥檢測方法的研究報道很多，如紫外分光光度法［6－7］、毛細(xì)管色譜法［8－9］、氣相色譜法［10－12］和高效液相色譜法［13－17］等，但同時實(shí)現(xiàn)18α－Gly，18β－Gly、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B分離檢測的研究尚未見文獻(xiàn)報道.本實(shí)驗(yàn)在參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)之上，考察了甘草酸類制劑及其原料藥中主成分和有關(guān)物質(zhì)同時分離檢測的色譜條件，對中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（WS1－XG－2002）收載的甘草酸類制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了改進(jìn)，可用于甘草酸單銨鹽原料藥和不同劑型制劑中有關(guān)物質(zhì)及含量的檢測，為其原料藥、制劑以及中藥材的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一定依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC－10ATvp高效液相色譜儀（日本島津公司）、SPD－M10Avp二極管陣列檢測器（DAD）、CLASS－VP工作站；超純化水機(jī)（重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司）；AUW120D十萬分之一電子分析天平（日本島津公司）；DELTA－320型酸度計（梅特勒－托利多儀器有限公司）；TGL－16G型臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）.

18α－Gly對照品（批號：10B001S，ALPS制藥）、18β－Gly對照品（批號：05C11S，ALPS制藥）、甘草酸單銨鹽雜質(zhì)A對照品（批號：10B002S，ALPS制藥）、甘草酸單銨鹽雜質(zhì)B對照品（批號：10B003S，ALPS制藥）、甘草酸單銨鹽原料藥（批號：10EA，11C8，06802N130，A廠）、復(fù)方甘草酸苷片（規(guī)格：35mg／片，B廠）、復(fù)方甘草酸苷膠囊（規(guī)格：35mg／粒，C廠）、復(fù)方甘草酸苷注射液（規(guī)格：53mg／支，B廠）、注射用復(fù)方甘草酸單銨S粉針劑（規(guī)格：40mg／支，D廠）.高氯酸銨、氨水、高氯酸、冰醋酸、三乙胺、磷酸均為分析純，甲醇、乙腈為色譜純（天津市康科德科技有限公司），水為二次去離子水.

1.2 色譜條件

1.2.1 改進(jìn)方法的色譜條件

色譜柱：Durashell－C18柱（4.6mm×250mm，5μm），北京艾杰爾科技有限公司；流動相：0.01mol／L高氯酸銨（氨水調(diào)節(jié)pH至8.20）－甲醇（體積比為48∶52）；流速0.80mL／min；檢測波長254nm；柱溫50℃；進(jìn)樣量10μL.

1.2.2 中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)收載的甘草酸類制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的色譜條件

色譜柱：Durashell－C18柱（4.6mm×250mm，5μm），北京艾杰爾科技有限公司；流動相：0.01mol／L磷酸－乙腈（體積比為62∶38）；流速0.80mL／min；檢測波長254nm；柱溫35℃，進(jìn)樣量10μL.

1.3 溶液的配制

對照品溶液：精密稱定18α－Gly，18β－Gly、雜質(zhì)A和雜質(zhì)B對照品適量，分別置于10mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶解、定容，分別配制成質(zhì)量濃度為1mg／mL的對照品儲備液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?精密量取適量對照品儲備液，置于10mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液定容，作為對照品溶液.分別精密量取各對照品儲備液適量，置于同一容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液定容，搖均，作為混合對照品溶液.

原料藥供試品溶液：精密稱定各甘草酸單銨鹽原料藥適量，分別置于50mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶解、定容，分別配制成質(zhì)量濃度為1mg／mL的甘草酸單銨鹽原料藥供試品儲備液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?精密量取上述原料藥供試品儲備液適量，置于10mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液定容，得到質(zhì)量濃度為50μg／mL原料藥供試品溶液.

不同劑型制劑供試品溶液：取片劑20片，去除糖衣，精密稱定總質(zhì)量，求得平均片重，研細(xì).取膠囊劑20粒，精密稱定總質(zhì)量，求得平均粒重，取其內(nèi)容物混均.精密稱定上述片劑、膠囊劑各0.1g，粉針劑0.25g，注射液10mL，分別置于25mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)50%甲醇，超聲處理40min，冷卻至室溫，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度約為1mg／mL制劑供試品儲備液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?精密量取制劑供試品儲備液0.5mL，分別置于10mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液定容，得到質(zhì)量濃度為50μg／mL供試品溶液.

2 方法與結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

分別量取復(fù)方甘草酸苷片空白輔料溶液、混合對照品溶液、制劑供試品溶液、制劑供試品溶液中加入混合對照品溶液，按照“1.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，空白輔料溶液（A）、混合對照品溶液（B）、制劑供試品溶液（C）和制劑供試品溶液加入混合對照品（D）改進(jìn)方法HPLC色譜圖見圖1.結(jié)果表明，4種物質(zhì)均能有效分離，且空白輔料溶液對測定無干擾.

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系

圖1 改進(jìn)方法的HPLC色譜Fig.1 HPLC chromatograms of improve method

分別精密量取18α－Gly，18β－Gly、雜質(zhì)A和雜質(zhì)B對照品儲備液適量，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液逐級稀釋為100.0，50.0，25.0，10.0，5.0，2.5，1.0，0.5μg／mL系列質(zhì)量濃度溶液，按照“1.2.1”項(xiàng)色譜條件上機(jī)分析，記錄色譜圖.采用最小二乘法對各物質(zhì)峰面積（A）與溶液質(zhì)量濃度（ρ）進(jìn)行線性回歸，18α－Gly，18β－Gly，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B回歸方程分別為：A＝7.090×103ρ＋2.493×103（r＝0.999 9）；A＝7.606×103ρ－5.148×102（r＝0.999 9）；A＝1.289×104ρ－8.416×102（r＝0.999 9）；A＝1.220×104ρ－4.932×103（r＝0.999 9）.結(jié)果表明18α－Gly，18β－Gly，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B均在0.5～1.0×102μg／mL質(zhì)量濃度內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系.

2.2.2 檢出限

精密量取18α－Gly，18β－Gly、雜質(zhì)A和雜質(zhì)B對照品儲備液，分別用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液逐級稀釋，按照“1.2.1”中色譜條件上機(jī)分析，記錄色譜圖.以信噪比為3∶1的濃度確定其檢出限，18α－Gly，18β－Gly，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B檢出限分別為0.1，0.1，0.15，0.15μg／mL.

2.2.3 精密度

精密吸取“1.3”中混合對照品溶液，按照“1.2.1”色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，4種待測物峰面積的RSD為0.4%～1.0%（n＝6）.

2.2.4 重現(xiàn)性

精密吸取復(fù)方甘草酸苷注射液溶液6份，按“1.3”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件進(jìn)行分析，4種待測物峰面積的RSD為1.2%～1.7%（n＝6）.

2.2.5 穩(wěn)定性

精密吸取“1.3”復(fù)方甘草酸苷注射液供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件，分別在0，1，3，5，7，10d時進(jìn)行測定.4種待測物峰面積的RSD為0.7%～1.9%（n＝6），結(jié)果表明，供試品溶液在10d內(nèi)檢測穩(wěn)定性良好.

2.2.6 回收率

精密稱定復(fù)方甘草酸苷片0.05g、復(fù)方甘草酸苷膠囊0.05g、注射用復(fù)方甘草酸單銨S粉針劑0.125g，精密量取復(fù)方甘草酸苷注射液5mL，每種劑型各6份，分別加入適量18α－Gly，18β－Gly，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B對照

品，按“1.3”方法制備供試品溶液，按照“1.2.1”色譜條件上機(jī)分析.加樣回收率見表1.

表1 甘草酸不同劑型制劑中主成分及其有關(guān)物質(zhì)的加樣回收率（n＝6）Tab.1 Recovery studies of principal component and related substances of different dosage form of glycyrrhizin preparations（n＝6）

2.3 改進(jìn)方法與中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)方法測定結(jié)果比較

取對照品溶液，按照“1.2.1”色譜條件上機(jī)分析，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的25%.分別取3批次原料藥和制劑供試品溶液，按“1.2.1”和“1.2.2”色譜條件上機(jī)分析，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3倍，分別計算幾種待測物的含量.改進(jìn)方法測定結(jié)果及改進(jìn)方法與中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)方法對甘草酸總含量測定結(jié)果的比較見表2，改進(jìn)方法色譜圖見圖1，標(biāo)準(zhǔn)檢測方法色譜圖見圖2.

結(jié)果表明，中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中收載的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，只能檢測18α－Gly和18β－Gly的總含量，不能實(shí)現(xiàn)對異構(gòu)體的有效分離，沒有對有關(guān)物質(zhì)檢測及限度問題作出明確規(guī)定；本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)的方法，能夠在單一流動相、單流速、等度洗脫條件下同時分離甘草酸單銨鹽原料藥及其制劑中18α－Gly，18β－Gly，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B，并能檢測4種待測物的準(zhǔn)確含量.由表2可知，2種方法對甘草酸主成分總含量的測定結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05），說明改進(jìn)方法準(zhǔn)確性良好，可用于甘草酸單銨鹽原料藥和制劑中甘草酸差向異構(gòu)體及有關(guān)物質(zhì)的含量測定，為其原料藥、制劑以及中藥材的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一定依據(jù).

表2 甘草酸單銨鹽原料藥及不同劑型制劑有關(guān)物質(zhì)含量改進(jìn)方法測定結(jié)果及與中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)方法對甘草酸總含量測定結(jié)果的比較（n＝3）Tab.2 Results of determination of related substances in raw material drug of ammonium glycyrrhizinate and different dosage form of glycyrrhizin preparations from the improve method and comparison of determination results of the total glycyrrhizic acid from the improve method and the detection method in national drug standards of China（n＝3）

圖2 采用中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)收載的甘草酸單銨鹽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法得到的HPLC色譜Fig.2 HPLC chromatogram of raw material drug of ammonium glycyrrhizinate from the detection method in the national drug standards of China

3 討論

3.1 流動相的選擇

實(shí)驗(yàn)分別考察了流動相中有機(jī)相（乙腈和甲醇）、鹽或酸的種類及濃度（冰醋酸、高氯酸、高氯酸銨、磷酸和磷酸鹽緩沖液）對異構(gòu)體和有關(guān)物質(zhì)的分離效果、靈敏度和保留時間的影響.結(jié)果表明，以0.010mol／L高氯酸銨－甲醇為流動相時，效果最佳.

實(shí)驗(yàn)考察了流動相pH（6.45～8.93）對4種待測物色譜峰的分離度、靈敏度以及保留時間的影響（見圖3－A）.結(jié)果表明，在pH≥7的條件下方能實(shí)現(xiàn)對異構(gòu)體的同時分離.但在中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（WS1－XG－2002）中，流動相為酸性體系，對18α－Gly，18β－Gly沒有分離選擇性（圖2）.兼顧分離度和靈敏度的要求，選擇pH值為8.20.

實(shí)驗(yàn)考察了流動相中高氯酸銨濃度（0.005～0.100mol／L）以及甲醇加入比例（45%，50%，52%，55%，60%，V／V）對分離度、靈敏度以及保留時間的影響（圖3－B、圖3－C）.結(jié)果表明，當(dāng)高氯酸銨濃度為0.010mol／L、甲醇加入比例為52%（V／V）時，效果最佳.

圖3 流動相體系對靈敏度和保留時間的影響Fig.3 Influence of the mobile phase on sensitivity and retention time

3.2 柱溫和流速的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了柱溫（25，30，40，45，50℃）以及流速（0.40～1.20mL／min）對分離度、靈敏度以及保留時間的影響.柱溫50℃、流速0.80mL／min為實(shí)驗(yàn)最佳選擇.

3.3 改進(jìn)方法與中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中檢測方法與含量測定結(jié)果的比較分析

針對現(xiàn)行中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（WS1－XG－2002）收載的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，不能實(shí)現(xiàn)對主成分異構(gòu)體的同時分離，以及沒有對有關(guān)物質(zhì)的限度檢查作出明確規(guī)定等問題，課題組參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，優(yōu)化了色譜條件，建立了同時分離檢測甘草酸原料藥以及各種劑型制劑中主成分異構(gòu)體18α－Gly和18β－Gly和有關(guān)物質(zhì)的方法.本方法分析時間短，結(jié)果準(zhǔn)確可靠.與中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（WS1－XG－2002）收載的甘草酸類制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較，采用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對甘草酸總含量進(jìn)行測定，測定結(jié)果無顯著性差異.本方法能夠更全面反映原料藥及制劑的質(zhì)量情況，滿足質(zhì)量檢測中對原料藥及不同劑型制劑中各成分單獨(dú)進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測的要求.本方法的建立為中國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中對甘草酸原料藥及不同劑型制劑的增補(bǔ)與修訂，以及在中國藥典中增補(bǔ)相關(guān)內(nèi)容提供了依據(jù)，可用于原料藥及不同劑型制劑樣品的分析測定.

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