于銘茹 YU Ming-ru

（國家海洋標準計量中心，天津 300112）

（National Center of Ocean Standards and Metrology，Tianjin 300112，China）

0 引言

泥蚶（Tegillarca granosa）隸屬軟體動物門（Mollusca）、瓣鰓綱（Lamellibranchia）、翼形亞綱（Pteriomorphia）、蚶目（Arcoida）、蚶科（Arcidae）、蚶屬（Tegillarca），俗稱血蚶、寧蚶、花蚶、銀蚶、蚶子等，屬熱帶及溫帶生物，是一種棲息于沿海灘涂的廣溫性廣鹽性雙殼類軟體動物。泥蚶為灘涂中營埋棲生活的種類，喜棲于中、低潮區(qū)交界處，在生態(tài)上和經(jīng)濟上都具有重要作用。

浙江樂清灣（介于東經(jīng) 120°2′-120°10′和北緯 27°58′-28°24′之間）位于浙江省甌江口的北側(cè)，是一個葫蘆形的內(nèi)灣，灣長40km，平均寬度10km，全灣有水面270km2，標準水面上的灘涂約200km2，是我國最大的泥蚶苗種生產(chǎn)和養(yǎng)殖基地，泥蚶苗種產(chǎn)量占全國市場份額的80%以上，有“中國泥蚶之鄉(xiāng)”之稱，也是我國較早研究人工育苗和中間培育的場所，每年為南方各省開展泥蚶養(yǎng)殖提供一定數(shù)量苗種。由于近年來海上活動的日益增加，海洋環(huán)境急劇惡化，海洋資源嚴重受損，泥蚶賴以生存的生態(tài)環(huán)境遭破壞，天然資源日趨衰竭，產(chǎn)量每況愈下。發(fā)展泥蚶增養(yǎng)殖業(yè)，需要得到高質(zhì)量的精子和卵子以保證幼蟲的健康，為了得到高質(zhì)量的精子和卵子，有必要了解泥蚶自然群體的狀況，故對該地區(qū)泥蚶繁殖生物學的研究十分必要。到目前為止，關(guān)于泥蚶的繁殖生物學研究，國內(nèi)林志強等[1]對人工育苗作過研究，鄭家聲等[2]研究了山東省乳山灣泥蚶的性腺發(fā)育和生殖周期；而對樂清灣泥蚶繁殖生物學研究至今未見詳細報道。本研究對浙江省樂清灣圍塘泥蚶的繁殖周期及環(huán)境因子進行了周年調(diào)查，旨在為保護和利用浙江樂清灣泥蚶的種質(zhì)資源，提高樂清灣泥蚶在養(yǎng)殖及開展良種選育等工作提供基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)，為我國泥蚶的人工育苗技術(shù)深入研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 自2010年3月至2010年8月于浙江樂清灣沿海圍塘采集泥蚶，每月下旬一次，每次隨機采集100-120個體，將樣品鮮活運回實驗室，并現(xiàn)場測定取樣海區(qū)海水的鹽度和溫度，同時采集采樣地海水樣品，采用分光度法[3]測定葉綠素a含量。

1.2 肥滿度 每月取30個個體解剖，測量殼高，殼長，殼寬，殼重，軟體部重，將軟體部和殼分別在105℃烘箱恒溫烘干至恒重，稱殼干重，軟體干重，計算肥滿度。

1.3 組織學 每個月取90-100個泥蚶個體，對樣品進行解剖、觀察，并將切取的一部分性腺組織用波恩氏液固定，常規(guī)石蠟包埋組織切片（切片厚度6μm），蘇木精-伊紅（H-E）染色。在顯微鏡下觀察每個月份泥蚶的性腺發(fā)育狀況。每個月份取5-10個雌性個體，每個個體觀察、測量50-100個卵母細細胞的直徑、求平均值以確定泥蚶性腺的成熟度。

1.3.1 試劑 無水乙醇（A.R，安徽安特生物化學有限公司）、二甲苯（A.R，無錫市佳妮化工有限公司）、苦味酸（A.R，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司）、甲醛（A.R，衢州巨化試劑有限公司、冰醋酸（A.R，國藥集團化學試劑有限公司）、石蠟（熔點56-58℃，國藥集團化學試劑有限公司）、明膠、中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3.2 實驗工具和儀器 手術(shù)剪，鑷子，解剖刀，稱量紙，酒精燈，量筒，樣品瓶，擦鏡紙，載玻片，蓋玻片：用100%酒精浸泡24h，酒精燈灼燒。

包埋機（全自動生物包埋機YD-6D）、切片機（TD-1508A輪轉(zhuǎn)式切片機）、烤片機（YD-B烤片機）、脫水機（生物組織脫水機YD-12G）、顯微鏡（熒光顯微鏡Nikon Eclipse80i,生物顯微鏡Nikon YS100）、染色機（電腦自動染色機YAB0700）、電子天平、離心機、分光光度計等。

1.3.3 實驗方法與步驟

①固定、保存。固定劑選用波恩（Bouin）液，固定24h，后換多次70%乙醇，褪色，直至洗去黃色。

②脫水。樣品退去黃色后依次放入80%酒精1h，95%酒精 30min，95%酒精 30min，100%酒精 30min，100%酒精30min。

③透明。樣品依次放入1/2純酒精1/2二甲苯1h，二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ20min。

④浸蠟。樣品依次放入1/2二甲苯1/2石蠟1h，純蠟Ⅰ1h，純蠟Ⅱ1h。

⑤包埋。包埋過程中要注意盡量避免產(chǎn)生氣泡而影響切片效果。

⑥切片、貼片、展片。采用輪轉(zhuǎn)式切片機，切片厚度為6 μm，后將切好的蠟片用1%明膠貼于干凈的載玻片上，加幾滴蒸餾水，酒精燈烘烤展片。

⑦染色。將烘干的切片依次放入二甲苯10min，1/2純酒精1/2二甲苯4min，100%乙醇4min，95%乙醇4min，80%乙醇4min，70%乙醇4min，50%乙醇 4min，蒸餾水 4min，蘇木精8min，染色后用自來水6min，酸酒精1min分色，50%乙醇 4min，95%乙醇 4min，曙紅 30s，90%乙醇 15s，100%乙醇Ⅰ2min，乙醇Ⅱ2min，1/2純酒精1/2二甲苯4min，二甲苯10min，二甲苯15min，取出切片后，立即用中性樹膠封片。

⑧烘干。封片后的切片自然風干或烘干。

⑨挑選比較清晰的切片進行顯微鏡觀察、拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件處理。對條件指數(shù)和卵母細胞直徑的測量數(shù)據(jù)用單因素方差分析（ANOVA）進行顯著性檢驗，月間的差異采用Turkey檢驗（P<0.05），圖片用 Adobe Photoshop CS 8.0.1 軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境因子的周年變化 圖1顯示了采樣圍塘海水水溫和鹽度的周年變化。其中水溫呈明顯的季節(jié)性變化，在6月份的時候達到最高值（29.8℃），隨后逐漸降低，至12月達到最低（4.5℃），之后溫度回升。鹽度為10.0-30.0，年平均值為22.7，7月和8月波動明顯，與研究期間2010年3-7月浙江樂清灣正值雨季，雨水較多有關(guān)。

圖2顯示了葉綠素a含量的周年變動模式。表現(xiàn)為春、夏季高，秋、冬季低的特點。3月份葉綠素a含量逐漸升高至6月達到最高值，含量為22.60μg/L。8月迎來次高峰，葉綠素a含量為22.43μg/L。隨后葉綠素a的含量逐漸下降，并于12月降至全年最低值，為2.43μg/L。此后，葉綠素a含量開始上升。

圖1 取樣圍塘水溫和鹽度的周年變化

圖2 取樣圍塘葉綠素a含量的周年變化

2.2 泥蚶生物學性狀和肥滿度的周年變化 表1為泥蚶的生物學性狀，月平均殼高的變化范圍為20.12-23.33 mm，月平均殼長為26.04-30.11mm，月平均殼寬為17.55-21.64mm，月平均軟體部濕重在1.12-2.65g之間變化，在12月，軟體部的濕重和干重都達到了最低值，分別為1.12g和 0.14g。

圖3顯示了泥蚶肥滿度的周年變化，波動不大，3月份起，肥滿度平均值開始增大，增殖期開始，5月份達到最大值7.74×10-2，此時正值卵巢內(nèi)的卵母細胞的大生長期，隨著成熟期和排放的來臨，肥滿度迅速下降，8月份達到最低值3.25×10-2，9月份為3.42×10-2，以后各月逐漸平緩穩(wěn)定，12月為3.30×10-2，此后又開始上升。

2.3 泥蚶繁殖周期 泥蚶配子發(fā)育和卵徑存在周年變化，泥蚶的配子發(fā)育具有明顯的季節(jié)性（圖5），卵徑月間差異顯著（P<0.05）。

參考Ivell，結(jié)合泥蚶性腺的組織學和外部形態(tài)特征，將泥蚶的性腺發(fā)育分為5個時期：增殖期，生長期，成熟期，排放期和休止期（圖4）。

表1 泥蚶的生物學性狀。平均值±標準差，n=30

圖3 泥蚶肥滿度的周年變化

第Ⅰ期，即增殖期，本期發(fā)育時間為3月初至4月底，隨著海區(qū)水溫的回升，此期性別剛剛分化，月平均水溫為16.6-20.6℃。組織切片觀察，雌性濾泡開始出現(xiàn)，濾泡腔大，濾泡壁由單層上皮構(gòu)成，配子發(fā)育剛剛開始。隨著濾泡壁開始增厚，卵巢內(nèi)出現(xiàn)單層不連續(xù)的卵原細胞，卵原細胞處在活躍增殖時期，胞體呈卵圓或三角形（圖4Ⅰ-O），3月份平均直徑約8.87μm，為全年最低值，至4月份，平均卵徑值可增至16.99μm（圖5），3月57.84%的個體處于Ⅰ期，4月74.47%的個體處于Ⅰ期（圖5）。雄性濾泡開始出現(xiàn)，體積小壁薄不規(guī)則，濾泡間結(jié)締組織豐富。濾泡壁上形成多層的精原細胞，數(shù)量逐漸增多，精原細胞呈圓形或三角形（圖4Ⅰ-T）。

第Ⅱ期，生長期，濾泡數(shù)量增加，體積增大，分布范圍廣。卵原細胞繼續(xù)分裂增殖，雌性濾泡腔內(nèi)空隙逐漸減少，卵原細胞逐漸分化，其一端已明顯地突向濾泡腔，呈長形或倒梨形有少量成熟卵子出現(xiàn)（圖4Ⅱ-O），本期發(fā)育時間主要為5月份，有60.78%的個體處于生長期，并有少量個體（8.82%）性腺發(fā)育成熟（圖5），此期平均卵徑為34.08 μm，水溫為27.2℃。雄性濾泡數(shù)量增多，體積增大，壁加厚，顏色加深，可觀察到精原細胞到精子各個生長階段，少量精子形成，至本期中，精原細胞約占濾泡截面積的50%以上（圖4Ⅱ-T）。

第Ⅲ期，成熟期，配子發(fā)育結(jié)束，產(chǎn)卵還未發(fā)生或剛剛開始。本期發(fā)育6月和7月為成熟期，性腺發(fā)育成熟的個體分別占42.50%和58.06%（圖5），有部分個體開始產(chǎn)卵，平均水溫為29.5-29.8℃。本期濾泡為全年最豐滿，僅少量結(jié)締組織存在，濾泡間的間隙基本消失。游離的成熟卵約占80%以上，卵子互相擠壓，成不規(guī)則形狀，有橢圓形、梨形、多邊形等（圖4Ⅲ-O），卵徑在6月份為42.20μm，7月卵徑達最大值，為 48.47μm（圖 5）。本期精巢達到全年最豐滿階段，濾泡腔內(nèi)充滿了成熟的精子，精子為鞭毛型，呈輻射狀排列，精子頭部朝向濾泡壁，尾部朝向濾泡腔（圖4Ⅲ-T）。

第Ⅳ期，排放期，自7月下旬開始，濾泡內(nèi)生殖細胞逐漸減少，開始出現(xiàn)大小不等的空腔，濾泡腔體積逐漸減小，雌雄排放期和成熟期均有重疊現(xiàn)象存在。雌性濾泡壁上僅剩少量卵母細胞，有些濾泡壁破裂，濾泡腔內(nèi)殘存少量成熟卵子（圖4Ⅳ-O），此期發(fā)育時間為7月下旬至 8月下旬，8月為排放鼎盛期，8月卵徑降低至18.57μm，部分個體產(chǎn)卵期會延續(xù)到11月份；雄性濾泡開始出現(xiàn)大小不等輻射狀的腔，濾泡萎縮，精子數(shù)量明顯減少，濾泡腔內(nèi)仍有少量精母細胞和精子存在（圖4Ⅳ-T）。

第Ⅴ期，即休止期，本期發(fā)育時間為9月至翌年2月，個別為排放期和增殖期，此期間，僅4.91%個體可辨雌雄，顯微鏡觀察卵徑減小現(xiàn)象明顯，故未進行測量計數(shù)。切片觀察濾泡空虛，變成一個大空腔，形狀不規(guī)則，濾泡壁薄，隨后濾泡逐漸變小直至消失，結(jié)締組織占據(jù)了整個性腺（圖4Ⅴ-ND），性腺發(fā)育完成一個周期。圖4所示為泥蚶性腺發(fā)育分期。

圖4 泥蚶性腺發(fā)育分期

3 討論

圖5 泥蚶卵徑和性腺發(fā)育狀況的周年變化

3.1 泥蚶的性腺發(fā)育周期與環(huán)境因子的關(guān)系 海洋貝類的繁殖周期受外部因素（溫度，鹽度，食物豐度等）和內(nèi)部因素（神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)等）共同影響[5]。貝類的繁殖策略可以認為是對周圍環(huán)境（如溫度和鹽度）和食物的可得性等的一種適應，因環(huán)境隨海區(qū)差異變化較大，不同海區(qū)海洋貝類性腺開始發(fā)育和產(chǎn)卵時間是不同的[6,7]。

3.1.1 水溫與繁殖周期關(guān)系 本實驗結(jié)果顯示，樂清灣圍塘大部分泥蚶配子發(fā)育的開始時間為3-4月，此時水溫16.6-20.6℃。本實驗的組織學結(jié)果顯示，5月份50%以上的個體的泥蚶處于Ⅱ期，并有部分個體性成熟，6月開始有個體產(chǎn)卵、排精，此時水溫為29.8℃，7月后大規(guī)模產(chǎn)卵、排精。由此可見，泥蚶產(chǎn)卵所需溫度要高于配子發(fā)育啟動所需溫度。

3.1.2 鹽度與繁殖周期關(guān)系 水域中的鹽度也會影響泥蚶的繁殖周期，泥蚶對鹽度適應能力強，成蚶在鹽度為10.4-32.5之間的海水中均能正常生活，不過在河口或海水鹽度較低的內(nèi)灣，雨季使海水鹽度降得過低時，泥蚶則向下層潛伏，出入水孔被淤閉，使其在泥層中受到保護，待鹽度上升后，泥蚶再回到上層，進行正常生活。樣品都是從淤泥里采集，觀察泥蚶存活情況，有個別死亡現(xiàn)象，9月開始雨水天氣減少，鹽度保持在30左右，采樣發(fā)現(xiàn)泥蚶存活率保持在較高水平，9月開始值翌年雨季前，存活率均超過95%。本實驗中，鹽度在3月到8月變化很大，在10.02-26.16之間波動，特別是6月中旬到8月上旬，鹽度一直維持在較低水平（10-14），主要原因是這段時間降雨過久，而樂清灣又屬內(nèi)灣，鹽度受降雨量影響明顯，實驗期間浙江省6月中旬至7月中旬經(jīng)歷2000-2010年少有的典型梅雨季節(jié)，而8月下旬鹽度增至26.16，并逐漸穩(wěn)定，泥蚶于8月進入產(chǎn)卵鼎盛期，據(jù)此判斷樂清灣泥蚶產(chǎn)卵具有雨季之后鹽度較高時開始大規(guī)模產(chǎn)卵的特點，該規(guī)律與Suja等[8]對分布在印度的兩個不同地區(qū)的嬰兒蛤的研究結(jié)果基本一致。而國內(nèi)的報道鮮有提到鹽度對泥蚶繁殖的影響，因此兩者之間的關(guān)系有待進一步研究。

3.1.3 食物與繁殖周期關(guān)系 本實驗對取樣圍塘的葉綠素a的含量進行了周年測定，3-6月葉綠素含量呈現(xiàn)快速增加的趨勢，且含量總體上處于較高水平，結(jié)合組織學觀察結(jié)果，樂清灣海區(qū)圍塘養(yǎng)殖泥蚶在3月至4月配子開始發(fā)育，而春季的葉綠素a的值也很高，餌料豐富，且溫度也超過發(fā)育起始最低溫度，符合性腺發(fā)育規(guī)律。泥蚶的配子發(fā)育不僅需要起始最低溫度（性腺發(fā)育生物學零度），也需要充足的餌料保障。6月份泥蚶配子發(fā)育進入生長期，葉綠素a的值達到最高（22.6μg/L），餌料最豐富，為泥蚶發(fā)育提供了良好的食物基礎(chǔ)，有重要的促進作用。8月泥蚶已進入排放鼎盛期，而葉綠素a的值達到次高峰（22.43 μg/L），水中浮游植物數(shù)量很大，平均溫度達次高峰29.7℃。9月到翌年2月，取樣圍塘海水葉綠素a含量較低，水中浮游植物數(shù)量很少，并且由于雨雪天氣，夏季至秋冬季溫度降低尤為迅速，致此段時期泥蚶性腺基本處于休止期，性腺不發(fā)育，極少數(shù)處在增殖期。

3.2 成熟度的判斷 本研究中通過測定肥滿度的周年變化，發(fā)現(xiàn)8-12月泥蚶的肥滿度波動不明顯，而同一時期，組織學觀察結(jié)果是泥蚶處于排放鼎盛期及休止期，盡管排放期間和排放后，肥滿度開始下降，兩者之間存在一定關(guān)系，但總體而言，在這一時期泥蚶的肥滿度未能很好的幫助我們準確判斷泥蚶的性腺成熟狀況，同時有研究指出，肥滿度作為魚類繁殖周期的判定標準，精確度并不很高，因此泥蚶的肥滿度不建議作為判斷泥蚶性腺成熟的直接標準。

3.3 雌雄同體問題 瓣鰓類中的雌雄同體現(xiàn)象較普遍[9,10]。本研究在1243個泥蚶性腺切片觀察結(jié)果表明，雌雄比例為1:1.13，雄性略多于雌性，與吳洪喜等[7]觀察相符，與鄭家聲等[2]對418顆生長在山東青島市薛家島鎮(zhèn)唐島灣的泥蚶觀察結(jié)果，雌雄比l:1.16很接近，本研究中未發(fā)現(xiàn)泥蚶雌雄同體現(xiàn)象，相關(guān)報道[2]也未提及發(fā)現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象，因此可以斷定泥蚶為雌雄異體貝類，不存在雌雄同體現(xiàn)象。

4 結(jié)論

本文對浙江省溫州市樂清灣圍塘養(yǎng)殖的泥蚶的繁殖生物學性狀、繁殖周期及其與環(huán)境因子（溫度、鹽度和葉綠素a含量）的關(guān)系進行了研究。泥蚶為雌雄異體，其性腺發(fā)育受到餌料豐富度的影響成周年變化，同時泥蚶產(chǎn)卵時所需溫度要高于配子發(fā)育啟動所需溫度，且具有雨季之后鹽度較高時開始大規(guī)模產(chǎn)卵的特點。泥蚶配子發(fā)育始于3-4月，配子主要在6、7月成熟，大規(guī)模產(chǎn)卵主要在8月份，雌雄異體。泥蚶卵徑的周年變化是判斷泥蚶成熟度的良好指標。海洋貝類的繁殖周期受外部因素和內(nèi)部因素共同影響，要真正了解控制泥蚶繁殖周期的生理機制還需要對影響其繁殖周期的內(nèi)部因素（神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)等）做大量的工作。

[1]林志強,汪德清,徐桂仙等.泥蚶人工育苗試驗報告[J].浙南水產(chǎn)科技,1980,1:1-11.

[2]鄭家聲,王梅林,王志勇等.泥蚶的性腺發(fā)育和生殖周期[J].青島海洋大學學報,1995,25(4):503-510.

[3]戴玉蓉,盧敬讓.養(yǎng)殖水體浮游植物葉綠素a的簡易測定[J].齊魯漁業(yè),1997,14:35-36.

[4]Ivell R.The biology and ecolog y of a brackish lagoon bivalve,Cerastoderma glaucum Bruguiere,in an English lagoon,the widewater,Sussex[J].J Moll Stud,1979,45:383-400.

[5]Berthelin C,Kellner K,Mathieu M.Storage metabolism in the Pacific oyster (Crassostrea gigas)in relation to summer mortalities and reproductive cycle(west coast of France)[J].Comp Biochem Physiol,2000,125 B:359-369.

[6]Ahn I Y,Surh J,Park Y G,et al.Growth and seasonal energetics of the Antarctic bivalve Laternula elliptica from King George Island,Antarctica[J].Mar Ecol Prog Ser,2003,257:99-110.

[7]Dridi S,Romdhane M S,Elcafsi M.Seasonal variation inweight and biochemicalcomposition ofthe Pacific oyster,Crassostrea gigasin relation to the gametogenic cycle and environmentalconditions ofthe Bizertlagoon,Tunisia [J].Aquaculture,2007,263:238-248.

[8]Suja N,Muthiah P.The reproductive biology of the baby clam,Marcia opima,from two geographically separated areas of India.Aquaculture,2007,273:700-710.

[9]樓允東.組織胚胎學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1996：223-238.

[10]陳品健,游嵐,倪法鴻.尖刀蟶的生殖周期[J].海洋科學，1994，18(4):38-42.