丁新彪，叢柏林，張 揚，靳永軒，祝 茜，王能飛，黃曉航

（1.山東大學（威海）海洋學院，山東 威海 264209；2.國家海洋局 第一海洋研究所 海洋生物活性物質(zhì)重點實驗室，山東 青島 266061）

南極大陸為地球上最冷最干的地區(qū)，常年被冰雪覆蓋，具有酷寒、烈風、干燥、強輻射等極端氣候環(huán)境。普里茲灣是南極大陸印度洋扇形區(qū)中最大的海灣，是除威德爾海和羅斯海之外的第三大海灣，地處世界最大的蘭伯特冰川所占據(jù)的地塹末端的冰川入海處，形成了廣闊的埃默里冰架，其下為一個具有不同深度、溫度、壓力、鹽度的沉積環(huán)境［1］。由于深海沉積物億萬年的沉積作用，不僅地質(zhì)條件復雜，所含礦物成分繁復，而且是最復雜的微生物棲息地［2］，形成集化學物質(zhì)和微生物于一體的特殊生態(tài)環(huán)境［3］。研究海洋沉積物微生物多樣性不僅可以為開發(fā)利用微生物資源提供重要的參考依據(jù)，甚至還可以為人類了解生命起源和進化提供重要的線索［4］。同時有研究證明這些低溫微生物在南極自然環(huán)境下的物質(zhì)循環(huán)、生物地球化學過程以及南極生態(tài)與環(huán)境系統(tǒng)中擔負著重要作用［5－6］。

酷寒等極端環(huán)境使南極成為一個重要的微生物資源庫，南極不僅是微生物新物種的生存繁衍地，更是產(chǎn)生如特殊酶類、多糖等新型生物活性物質(zhì)和先導化合物菌株的潛在種源地［7］。南極深海沉積物中的微生物經(jīng)歷長時間演變，已經(jīng)形成了適應惡劣環(huán)境的獨特機制［8］。近年來對南極微生物多樣性、特殊生理生化特性、產(chǎn)低溫酶等研究已成為許多專家學者的重點研究方向［9－10］。Bowman等［11］通過構(gòu)建16SrRNA文庫分別對南極大陸架不同深度沉積物中的細菌多樣性進行了研究，肖昌松等［12］對南極半島及舍得蘭群島海底沉積物的低溫菌進行了鑒定分析，這些研究都證實了南極深海沉積物中具有較豐富的微生物多樣性。但是目前，對南極普里茲灣深海沉積物中微生物多樣性研究還鮮見報道。

南極微生物低溫酶有獨特的動力學和分子學特征，低溫催化能力強，催化效率高。其低溫熱穩(wěn)定性在工業(yè)應用中具有高生長速率、高酶活力及高催化效率、生產(chǎn)過程可在0～20℃低溫和室溫下進行，尤其是南極低溫蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶等更具有廣闊的生物工程應用前景，已受到人們廣泛的關注［13－15］。Vazquez等［16］在南極喬治王島土壤中分離到了3株產(chǎn)胞外蛋白酶的低溫假單胞菌，發(fā)現(xiàn)其在20℃時具有最高的蛋白水解活性；錢文佳等［17］在南極海冰中篩選得到了一株產(chǎn)纖維素酶的假交替單胞菌，該菌株在0～10℃范圍內(nèi)均有較高的產(chǎn)酶能力；Ray等［18］從南極Schirmacher Oasis土壤中篩選到一株分泌酸性蛋白酶的耐冷型酵母Candidahumicola，其在低溫條件下具有較高的產(chǎn)酶能力，最適酶活溫度為37℃。

本研究以中國第29次南極科學考察采自南極普里茲灣及鄰近海域25個站位的海洋沉積物樣品為研究對象，通過細菌16SrRNA基因和真菌ITS基因序列擴增進行系統(tǒng)進化分析，初步揭示了南極普里茲灣及鄰近海域沉積物中少量可培養(yǎng)微生物的多樣性，對分離培養(yǎng)的細菌、真菌進行了初步的生理生化特性研究，篩選了一批具有產(chǎn)酶（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶等）特性的低溫微生物，為進一步研究和實際應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 采集站位

沉積物樣品來自中國第29次南極科學考察，考察區(qū)域位于普里茲灣及鄰近海域。用地質(zhì)箱式沉積物采樣器取樣，樣品采至甲板上，用無菌藥匙從樣品表面取樣10～20g，置于無菌離心管中4℃保存，備日后篩選培養(yǎng)。采集站位見表1。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 細菌培養(yǎng)

2216E培養(yǎng)基：蛋白胨5g，酵母粉1g，瓊脂18g，海水1 000mL，121℃（98.1kPa）高壓滅菌20min，加終濃度為100μg／mL制霉菌素以抑制真菌生長。

1.2.2 真菌培養(yǎng)

土豆培養(yǎng)基（PDA）：土豆200g，葡萄糖10g，瓊脂17g，121℃下高壓濕熱滅菌20min，蒸餾水1L，用于南極真菌的培養(yǎng)。

酶活性測定培養(yǎng)基［19］：

（1）淀粉酶：淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，瓊脂17g，蒸餾水1L。

（2）酪蛋白酶：酪蛋白4g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，瓊脂17g，蒸餾水1L。

（3）木質(zhì)素酶：在PDA培養(yǎng)基中加0.05%的苯胺藍后滅菌，產(chǎn)木質(zhì)素酶菌株可使苯胺藍褪色周圍有透明圈。

（4）纖維素酶：在PDA培養(yǎng)基中加0.05%的剛果紅后滅菌，產(chǎn)木質(zhì)素酶菌株可使剛果紅褪色周圍有透明圈。

（5）卡拉膠酶：卡拉膠2g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.000 2g，硫酸銨5g，海水1L。

1.3 菌株篩選純化及保存

1.3.1 細菌篩選純化及保存

稱取約1g采集的沉積物樣品置于10mL海水中，振蕩混勻后靜置過夜。將預處理后的樣品懸液系列稀釋至10－1、10－2，分別取100μL涂布2216E培養(yǎng)基平板，于12℃培養(yǎng)。培養(yǎng)4～7d后，根據(jù)菌落形態(tài)、色素、干燥等特征，挑取形態(tài)差異較大的細菌進行劃線純化。挑取純化后的單菌，于－80℃下用25%甘油保種。

1.3.2 真菌篩選純化及保存

將采集的沉積物樣品在8℃冰箱中自然晾干后，稱取約1g置于10mL無菌海水中，振蕩混勻后靜置過夜。將預處理后的樣品懸液系列稀釋至10－1、10－2，分別取100μL涂布PDA培養(yǎng)基平板，于12℃培養(yǎng)。培養(yǎng)1～2周后，根據(jù)菌落形態(tài)、色素、干燥等特征，挑取形態(tài)差異較大的真菌和放線菌進行劃線純化。挑取純化后的單菌，置于－80℃下用20%甘油保種。

1.4 分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

1.4.1 細菌16SrRNA擴增

細菌總DNA的提取按Tiangen細菌總DNA提取試劑盒操作說明進行。按照Tiangen 2×Taq PCR MasterMix說明書，采用通用引物27F：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′及1492R：5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′［20］，進行16SrRNA 基因的擴增。擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 30s，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。

1.4.2 真菌ITS基因序列擴增

將篩選純化的真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周后，刮取約50mg菌苔，于研缽中液氮研磨，參照Tiangen植物基因組DNA提取試劑盒操作說明提取真菌DNA。按照Tiangen 2×Taq PCR MasterMix說明書，采用引物ITS1：5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′和ITS4：5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′［21］進行ITS基因序列的擴增。擴增程序為：94℃DNA雙鏈預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

以上PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海桑尼生物科技有限公司測序。將細菌16S rRNA和真菌ITS基因序列測序結(jié)果提交至 GenBank數(shù)據(jù)庫（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／blast／blast.cgi）進行Blast相似性比較分析，選取與實驗菌株親緣關系較近的菌株及南極常見菌株用BioEdit軟件的Clustal W法進行多序列比對（multiple alignment），并用 Mega5.1軟件的鄰接法（neighbor－joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 菌株生理生化特性分析

1.5.1 細菌 API 20NE鑒定

采用API 20NE鑒定條（法國梅里埃公司）對分離培養(yǎng)的細菌進行生理生化指標測定，培養(yǎng)溫度設為12℃，判讀結(jié)果時間為48h，具體操作按API 20NE說明進行。

1.5.2 真菌產(chǎn)胞外酶活性

參照靳永軒［19］使用酶活性測定培養(yǎng)基的方法，篩選產(chǎn)胞外酶活性的真菌菌株。

（1）淀粉酶：在菌落周圍滴加碘液數(shù)分鐘后，遇到碘液不變?yōu)樗{色，證明有淀粉酶產(chǎn)生形成者為陽性，透明圈的大小表示淀粉酶活性強弱；（2）酪蛋白酶：在長出菌落的培養(yǎng)基上覆蓋40%的Cl3CCOOH，10～15min后倒去Cl3CCOOH溶液，菌落周圍出現(xiàn)透明圈者為陽性；（3）產(chǎn)木質(zhì)素酶菌株可使苯胺藍褪色，周圍有透明圈者為陽性；（4）產(chǎn)纖維素酶菌株可使剛果紅褪色，周圍產(chǎn)生透明圈者為陽性；（5）產(chǎn)卡拉膠酶菌株可在以卡拉膠為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長者為陽性。

2 結(jié) 果

2.1 分子鑒定與系統(tǒng)進化分析

從25份沉積物樣品中共獲得912株細菌和293株真菌，選取菌落形態(tài)、顏色、大小等特征差異較明顯的53株細菌和31株真菌分別進行16SrRNA和ITS鑒定，共鑒定得到12個屬的28株細菌和7個屬的10株真菌（表2、表3），根據(jù)細菌16SrRNA和真菌ITS基因序列構(gòu)建了菌株系統(tǒng)進化樹（圖1）。28株細菌分別屬于革蘭氏陽性菌的放線菌門（Actinobacteria，1株）、厚壁菌門（Firmicutes，2株）；γ－變形菌（γ－proteobacteria，23株）；α－變形菌（α－proteobacteria，1株）和擬桿菌門（Bacteroidetes，1株）。γ－proteobacteria中屬假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）最多，有8株。一般16SrRNA序列同源性＜98%則可認為屬于不同種［22－23］，菌株P7－9－1的16SrRNA序列最高同源性為97%，推測其可能是一個新種。真菌鑒定結(jié)果表明篩選得到的真菌屬于4個綱7個屬，分別為散囊菌綱（Eurotiomycetes）的青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）、座囊菌綱（Dothideomycetes）的枝孢屬（Cladosporium）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）的帚霉屬（Scopulariopsis）和Geosmithiapallida、微球黑粉菌綱（Microbotryomycetes）的紅酵母屬（Rhodotorula）和Glaciozyma，其中菌株P7－16－7與Geosmithiapallida（HF546256）最高同源性僅為88%，因此推測其可能為一個新種。綜上可知，南極普里茲灣及鄰近海域沉積物中存在較豐富的微生物多樣性。

表2 普里茲灣及鄰近海域沉積物中細菌的分離鑒定Table 2 Identification of bacteria isolated from the sediments of Prydz Bay and vicinity areas

表3 普里茲灣及鄰近海域沉積物中真菌的分離鑒定Table 3 Identification of fungi isolated from the sediments of Prydz Bay and vicinity areas

圖1 細菌16SrRNA和真菌ITS基因序列構(gòu)建的菌株系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic trees of bacterial 16SrRNA and fungi ITS sequences.The numbers at the nodes indicate the bootstrap values based on neighbour－joining analyses of 1000data sets，brackets are GenBank accession number

2.2 菌株的生理生化特性

用API 20NE試條對分離純化的28株細菌進行了8個傳統(tǒng)生化及酶反應指標鑒定，檢測結(jié)果見表4。其中67.8%的菌株可產(chǎn)生蛋白酶，2株產(chǎn)β－半乳糖苷酶，5株產(chǎn)β－葡萄糖苷酶。利用酶活性培養(yǎng)基對10株真菌進行產(chǎn)胞外酶活性篩選，測定結(jié)果見表5。雜色曲霉AspergillusversicolorC P6－8－1、球孢枝孢菌CladosporiumsphaerospermumC7－7－1可產(chǎn)生纖維素酶，產(chǎn)黃青霉PenicilliumchrysogenumK P6－10－4和南極酵母GlaciozymaK P7－5－1、K P7－5－2可產(chǎn)生卡拉膠酶。

表4 普里茲灣及鄰近海域細菌API生理生化測定結(jié)果Table 4 API physiological and biochemical characterization of bacteria isolated from the sediments of Prydz Bay and vicinity areas

表5 普里茲灣及鄰近海域真菌產(chǎn)胞外酶活性測定結(jié)果Table 5 Extracellular enzyme activity of fungi isolated from the sediments of Prydz Bay and vicinity areas

3 討 論

普里茲灣及其毗連陸架水體較為穩(wěn)定且富含有機質(zhì)成分［24－25］，為普里茲灣海底沉積物中微生物提供了很好的營養(yǎng)環(huán)境。以往對南極不同地區(qū)海底沉積物的研究表明，細菌主要包括變形菌、厚壁菌、放線菌、擬桿菌等多種類群［26－27］，本研究對采自普里茲灣海底沉積物的樣品篩選獲得的可培養(yǎng)細菌的鑒定，與之前在南極其它地區(qū)海底沉積物樣品所得到的結(jié)果基本相同。

在南極細菌研究方面，Zhang等［28］對普里茲灣深海沉積物中產(chǎn)淀粉酶細菌研究中發(fā)現(xiàn)γ－proteobacteria為優(yōu)勢菌群，其次為革蘭氏陽性菌；馬吉飛等［29］在研究南極普利茲灣夏季海冰中細菌群落豐度及組成中也發(fā)現(xiàn)γ－proteobacteria為優(yōu)勢類群。本研究在驗證了上述研究結(jié)果的同時，發(fā)現(xiàn)從普里茲灣及鄰近水域分離培養(yǎng)的細菌中，γ－proteobacteria不僅為絕對優(yōu)勢菌群，且以假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas居多。在南極真菌研究方面，目前該類研究還相對較少且大都集中于對南極土壤中真菌的研究方面?？兹A忠等［30］、靳永軒等［31］、陳皓文等［32］分離出南極不同島嶼土壤中的真菌類群，鑒定出有青霉、曲霉、枝孢霉、金孢霉、出芽短梗霉、散囊菌等，本研究在普利茲灣深海沉積物樣品中分離得到了枝孢霉屬、青霉屬、曲霉屬、帚霉屬、紅酵母屬（Rhodotorula）、Glaciozyma和Geosmithiapallida的菌株，但并未分離得到金孢霉和出芽短梗霉，分離得到菌株的不同可能與樣品來自土壤和水體等不同棲息環(huán)境有關，也可能與采樣地點的不同有關。

迄今為止，各國的科學家從極地冰芯、水樣、土壤、沉積物和巖石等發(fā)現(xiàn)了數(shù)量和種類繁多的微生物種群，而且發(fā)現(xiàn)了許多嗜冷、適冷微生物可以產(chǎn)生多種低溫降解酶類。纖維素是植物秸稈的主要成分，是地球表面數(shù)量最大的可再生生物能源，如能低溫條件下有效降解纖維素并對植物秸稈加以利用，將對當代環(huán)境保護和可持續(xù)的經(jīng)濟發(fā)展都有著重要的研究價值和廣闊的應用前景。能將纖維素降解的酶是一個酶系，纖維素的降解是多種酶共同作用的結(jié)果，其中β－葡萄糖苷鍵的水解是制約纖維素徹底降解為單糖的瓶頸［33］，本項研究篩選獲得了5株產(chǎn)β－葡萄糖苷酶的南極低溫細菌和2株產(chǎn)纖維素酶的真菌（雜色曲霉A.versicolorC P6－8－1和球孢枝孢菌C.sphaerospermumC7－7－1），這些能產(chǎn)生與纖維素降解相關的菌株，在工業(yè)發(fā)酵中將可能有潛在的應用價值。本研究還得到了2株產(chǎn)β－半乳糖苷酶的南極細菌。Turkiewicz等［34］2003年從南極磷蝦的消化道內(nèi)分離出一株產(chǎn)β－半乳糖苷酶的海洋菌Pseudoalteromonassp.22b，該菌可在低溫下快速降解乳糖并能排除在較高溫度下中溫微生物的污染，因此獲得產(chǎn)β－半乳糖苷酶的南極細菌同樣可能有潛在的應用價值。綜上所述，通過對普里茲灣及鄰近海域25個站位的沉積物樣品中可培養(yǎng)微生物的多樣性與生理生化進行初步研究，篩選獲得了一批具有產(chǎn)酶特性的低溫微生物，為進一步的應用研究奠定了基礎。

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