高 翔，楊柏林，丁光輝，熊德琪

（大連海事大學 環(huán)境科學與工程學院，遼寧 大連 116026）

隨著石油工業(yè)和海上運輸業(yè)的發(fā)展，各類溢油事故頻發(fā)［1］，大量石油烴通過各種途徑進入海洋。溢油污染已經嚴重損害了海洋生態(tài)環(huán)境［2］，并給我國海洋漁業(yè)，海洋生物資源造成了極大損失［3－6］。溢油污染使得海底環(huán)境油污染程度日益增高，破壞了底棲生物的生存環(huán)境，對底棲生物的生長、繁殖產生不同程度的影響［7］。更為嚴重的是，石油烴會通過生物攝取進入食物鏈，進而在人體中富集，而它在人體內的持久存在會對人類健康產生極大的負面影響［8－11］。因此，石油烴污染對海洋生物產生的毒性效應以及海洋環(huán)境的石油烴污染監(jiān)測亟待人們深入研究。

目前，國內外研究人員已經開展了大量關于石油烴污染對海洋生物毒性效應方面的研究［12－17］，但大部分研究主要針對原油對海洋浮游植物及魚貝類的毒性效應［18－21］。前人的研究發(fā)現(xiàn)石油烴污染會造成魚貝類氧化脅迫，抑制其酶活性，產生遺傳毒性和生物蓄積作用［22－24］，而其對海洋底棲生物的毒性效應和致毒機理尚不完全明確。大量實驗結果表明，當海水中石油的質量濃度為1mg／L或溶于水的石油烴的質量濃度為1μg／L時，就能對敏感生物產生危害［25］。國內外許多研究也已經證實輕質燃油的毒性較其它油品更大［26－28］。谷胱甘肽（GSH）作為生物體內抗氧化系統(tǒng)的一部分，對污染物的脅迫十分敏感，其活性變化可為污染物脅迫下機體的氧化應激反應提供敏感信息。因此，GSH被作為分子生物標志物廣泛用于環(huán)境污染的早期預警。綜上，本研究選取國內常用的船用輕質燃油——0號柴油作為受試油品，以國內常見的海洋底棲生物——馬糞海膽作為受試生物，考察了石油烴污染對海膽體內GSH含量的影響，為評估溢油污染對海洋底棲生物的毒性效應并尋找適合檢測石油烴污染的生物標志物提供一定依據(jù)。

1 實驗材料和方法

1.1 受試生物

本實驗采用的馬糞海膽（Hemicentrotuspulcherrimus）購于大連碧龍海珍品養(yǎng)殖公司。在水溫18±2℃、鹽度31.4的實驗室條件下暫養(yǎng)3個月后，選擇健康、反應靈活、大小一致的海膽進行實驗。實驗用海膽直徑6±0.2cm、體重67.2±4.6g、30個月齡左右。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：JDS－109U紅外測油儀（吉林市北光分析儀器廠）；JB－3型磁力攪拌器（上海市悅豐儀器儀表有限公司）；Beckman J2－MC型高速冷凍離心機（BECKMAN美國公司）；BS210S萬分之一電子天平 （北京賽多利斯天平公司）。

主要試劑：GSH檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；紅外測油專用四氯化碳（天津光復精細化工研究所）。

1.3 受試液的制備

1.3.1 過濾海水

砂濾海水取自大連市星海灣，其鹽度為31.35，電導率為47.3ms／cm，pH值為8.130。

1.3.2 0號柴油分散液（WAFs）的制備

本研究所用0號柴油由大連市海事局提供。將0號柴油與過濾海水按體積比1∶9混合，磁力攪拌器低速攪拌24h，靜置4h后，分離下層水相即為母液。將母液置于4℃環(huán)境中避光保存，實驗前稀釋至所需質量濃度。

1.3.3 0號柴油分散液（WAFs）石油烴質量濃度的測定

本實驗參照GB／T16488－1996《水質石油類和動植油的測定》所介紹的紅外光度法測定母液中的石油烴質量濃度：1）用CCl4分兩次萃取水體中的石油烴；2）將萃取液通過特定活性的硅酸鎂吸附，脫除動植物油等極性化合物；3）將其置于紅外測油儀中，分別于波數(shù)為2 930，2 960和3 030cm－1譜帶處測得吸光度A2930、A2960和A3030，并進行計算。計算公式為：

式中，C為溶劑中石油烴質量濃度；X、Y、Z為各波長對應的校正系數(shù)；F為脂肪烴對芳烴的影響校正因子。

1.4 暴露實驗

暴露實驗按照0號柴油分散液的質量濃度差異設置為低質量濃度組（5mg／L）、中質量濃度組（20mg／L）、高質量濃度組（50mg／L）。每組隨機選取馬糞海膽5只（不區(qū)分雌雄），置于32cm×16.5cm×24cm玻璃缸中采用靜水法避光暴露，暴露溶液總體積為6 500mL。實驗期間每隔12h換受試液一次，并投入一定的餌料。暴露時長為13d，之后為恢復期。分別于暴露1、5、9、13和24d后進行海膽體內GSH含量的分析和測定。

1.5 GSH含量測定

用電子天平準確稱量一定質量的海膽組織（腸和性腺）。用4℃預冷的滅菌注射器準確抽取一定體積（80μL）的海膽體液，分別置于1mL離心管中。然后加入pH為7.8的磷酸緩沖液或生理鹽水稀釋9倍后，用勻漿儀沖搗制成10%的組織勻漿液，轉移至1.5mL離心管中（冰上操作）。將離心管置于高速冷凍離心機中，以9 000r／min（約為9 257.14g）的轉速離心20min，取上清液，置于4℃環(huán)境中保存。GSH及蛋白質含量（考馬斯亮藍法）的測定均按照試劑盒方法進行操作。

測定組織中GSH含量時，所采用單位為：U／mgprot，表示每mg蛋白質中的活力單位。測定體現(xiàn)中GSH含量時所用單位為U／mL，表示每mL液體中的活力單位。

1.6 數(shù)據(jù)處理

1.6.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析：當P≤0.05時認為差異顯著；P≤0.01時認為差異極顯著。

1.6.2 誘導率及抑制率計算方法

1）誘導率計算公式：

式中，Ni為實驗組受誘導后GSH含量；N為對照組GSH含量。

2）抑制率計算公式：

式中，Ns為實驗組受抑制后GSH含量；N為對照組GSH含量。

2 實驗結果與分析

2.1 馬糞海膽體內GSH含量的組織分布

將正常生理條件下馬糞海膽體內的GSH含量加以統(tǒng)計（表1），由表1可見，在正常條件下海膽的腸、體液和生殖腺中GSH含量有明顯差異。

表1 馬糞海膽GSH含量在各組織中的分布情況Table 1 The tissue distributions of GSH content in Hemicentrotus Pulcherrimus

2.2 0號柴油分散液對馬糞海膽腸道GSH含量的影響

0號柴油分散液對海膽腸道GSH含量影響的實驗結果如圖1所示。整個實驗周期內海水對照組的GSH含量基本穩(wěn)定。低質量濃度組GSH含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在9d時GSH含量達到峰值；中質量濃度組GSH合成在5d時受到誘導，含量較1d時有顯著上升，暴露9d時GSH含量較5d時變化不大，13d時含量則大幅降低；高質量濃度組GSH合成在1d時即受到誘導，含量明顯上升，并在此后幾天持續(xù)下降。3個質量濃度組腸道GSH含量隨時間的變化基本上遵循先升高后降低的規(guī)律，而高質量濃度組GSH含量在1d時即達到峰值，為對照組的152%，時間－劑量效應十分顯著。當24d完成恢復實驗時，3個質量濃度組之間GSH含量基本趨于一致，無明顯差異。

2.3 0號柴油分散液對馬糞海膽體液GSH含量的影響

0號柴油分散液對海膽體液中GSH含量影響實驗結果如圖2所示。整個實驗周期中海水對照組GSH含量基本不變。由圖2可知：低濃度組在暴露5d時GSH含量開始升高并在9d時達到最大值，在13d時GSH含量回落，且下降幅度較大；中濃度組在暴露1d時GSH含量較對照組明顯偏低，在暴露5d后GSH合成受到誘導而上升，并在9d時達到峰值，13d時GSH含量回落；高濃度組在暴露1d時GSH含量偏高并持續(xù)上升，在5d時達到最大值，暴露9d時GSH含量顯著下降，13d時含量與9d時基本持平。3個濃度組體液GSH含量隨時間的變化基本上遵循先升高后降低的規(guī)律，時間－劑量效應明顯。當24d完成恢復實驗時，3個質量濃度組之間GSH含量基本恢復，與對照組無顯著差異。

圖1 0號柴油分散液影響馬糞海膽腸道GSH含量的時間－效應曲線Fig.1 The time－effect responses of GSH content in intestine of Hemicentrotus pulcherrimus

圖2 0號柴油分散液影響馬糞海膽體液GSH含量的時間－效應曲線Fig.2 The time－effect responses of GSH content in coelomic fluid of Hemicentrotus pulcherrimus

2.4 0號柴油分散液對馬糞海膽生殖腺GSH含量的影響

0號柴油分散液對海膽生殖腺GSH含量影響實驗結果如圖3所示。暴露1d時，低、中、高質量濃度組GSH含量均有所上升，且上升幅度與分散液濃度呈線性關系，組間差異較大；低質量濃度組GSH含量在暴露5d時繼續(xù)上升且到達峰值，在9、13d時GSH含量持續(xù)下降；中質量濃度組在暴露1d時GSH含量即達到最大值，并在5、9、13d時依次下降；高質量濃度組所呈現(xiàn)趨勢與中質量濃度組基本一致，即GSH含量在1d時達到最大值，并在此后呈現(xiàn)下降趨勢。由實驗結果可知，3個質量濃度組生殖腺中GSH含量隨時間延長，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，時間－效應關系明顯。當24d完成恢復實驗時，3個質量濃度組之間GSH含量已趨于一致。

圖3 0號柴油分散液影響馬糞海膽生殖腺GSH含量的時間－效應曲線Fig.3 The time－effect responses of GSH content in gonad of Hemicentrotus pulcherrimus

2.5 0號柴油分散液暴露下GSH含量的變化規(guī)律比較

為了直觀地說明0號柴油分散液對馬糞海膽GSH含量的影響，將暴露期間海膽體內GSH含量變化情況列于表2中。

表2 不同質量濃度0號柴油分散液對GSH含量影響比較Table 2 Effects of concentration of WAFs on GSH content

由表2可見：

1）當海膽暴露于0號柴油分散液后，體內GSH含量會發(fā)生明顯變化：GSH作為生物體內一種重要的抗氧化劑，可以有效地清除體內過多的活性氧。結合GSH含量的變化可知：暴露初期，海膽受到石油烴脅迫后，體內活性氧含量增加，使機體處于氧化應激狀態(tài)，從而產生適應性誘導反應，導致GSH含量上升。隨著時間的延長，當石油烴持續(xù)作用產生的氧化脅迫超出了機體適應性反應的抵御能力時，會使生物體產生中毒反應，進而抑制GSH的合成，導致體內GSH含量降低。

GSH最大誘導量的高低與暴露時間的長短及柴油分散液質量濃度有關。實驗前期各組織中GSH含量基本呈現(xiàn)上升趨勢。說明在暴露前期GSH含量會受分散液影響，誘導其合成，且最大誘導量隨分散液質量濃度升高呈現(xiàn)上升趨勢。這與陳榮等［29］所研究的石油暴露對僧帽牡蠣谷胱甘肽含量的影響的實驗結果相一致。隨著暴露時間延長，GSH受毒性作用影響合成受到抑制，其含量開始下降，且中低質量濃度組抑制率普遍較高濃度組高。Richardson等［30］研究多環(huán)芳烴暴露下的貽貝體內GSH含量的變化、鄭微云等［31］及羅朝暉等［32］分別研究0號柴油水溶性成分對真鯛、褐菖鲉臟器組織中GSH含量的影響、Cheung等［33］研究苯并［a］芘暴露對貽貝的GSH含量的影響，都得到了相似的結論。

2）馬糞海膽在正常生理條件下，體內GSH含量存在組織差異性，這與不同組織的生理結構和功能有關。其中體液中GSH的含量高于組織，而組織中GSH含量的大小順序為腸＞生殖腺。通過比較暴露實驗數(shù)據(jù)可知：在受到誘導時，組織中GSH變化量的大小表現(xiàn)為組織＞體液，而在組織中腸的變化量＞生殖腺。這可能是由于海膽體內GSH主要來源是腸，而體液中的GSH則是外源性的。

高質量濃度組GSH最大誘導量出現(xiàn)時間早于低質量濃度組，是由于高質量濃度污染產生的誘導信號較強，由此海膽的適應性誘導反應較中、低質量濃度組更為顯著。結合Steadman等［34］及汪美珍等［35］分別對虹鱒魚和黑斑蛙的研究結果，發(fā)現(xiàn)較低質量濃度下，在未被誘導合成的污染初期，GSH作為抗氧化劑被大量消耗，而誘導在時間上又有一定的滯后性，因此GSH含量變化表現(xiàn)出誘導期的延后。

3 結 論

本文研究了0號柴油分散液對馬糞海膽體內各組織中GSH含量的影響，得到如下結論：

（1）海膽暴露后各組織中GSH含量隨暴露時間的延長呈現(xiàn)先誘導后抑制的趨勢。說明機體既可在石油烴暴露下產生適應性誘導反應（GSH含量上升），也可由于其毒性作用而產生中毒反應，導致GSH含量下降。

（2）GSH最大誘導量出現(xiàn)的時間隨分散液質量濃度的降低而有所延后。分散液質量濃度與最大誘導量呈現(xiàn)正相關關系，而與抑制率呈現(xiàn)負相關關系。

（3）馬糞海膽體內GSH含量在暴露前后都呈現(xiàn)出組織差異性，表現(xiàn)為暴露前體液＞腸＞生殖腺，而當GSH受到誘導時，其變化量則表現(xiàn)為腸＞生殖腺＞體液。

（4）0號柴油分散液暴露后，海膽體內GSH含量變化的劑量－效應和時間－效應關系顯著。證明GSH含量對石油烴暴露較為敏感，適合作為監(jiān)測石油烴污染的生物標志物。

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