蘇寧寧，張麗萍

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

黨參種子真實(shí)性鑒定研究△

蘇寧寧，張麗萍*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

目的：研究黨參種子真實(shí)性鑒別方法，為黨參種子品種鑒定以及黨參種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。方法：對(duì)不同來(lái)源黨參分別進(jìn)行了種子蛋白的SDS-PAGE電泳，子葉蛋白的SDS-PAGE電泳，子葉蛋白的非變性凝膠電泳。結(jié)果：三種電泳結(jié)果顯示，種子蛋白的SDS-PAGE電泳，譜帶清晰，分離到的差異譜帶多；子葉蛋白的SDS-PAGE電泳，譜帶模糊；子葉蛋白的PAGE電泳，譜帶雖然清晰但是沒(méi)有分離到有差異的譜帶。結(jié)論：黨參種子真實(shí)性鑒定應(yīng)選擇種子蛋白的SDS-PAGE電泳，通過(guò)電泳分析得到陜西鳳縣，甘肅文縣，四川野生的親緣關(guān)系比較近，比其他地方的黨參種子多出一條Rf值大約為0.060的譜帶，根據(jù)Marker蛋白譜帶可以初步推斷這個(gè)差異蛋白的分子量為170 KDa。

黨參；真實(shí)性鑒別；電泳方法

黨參Codonopsispilosula(Franch.)Nannf為桔?？艭ampanulaceae多年生草本植物。現(xiàn)代藥理研究表明，黨參具有調(diào)節(jié)血糖，促進(jìn)造血，降壓，抗缺氧，耐疲勞，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，調(diào)節(jié)胃腸收縮及抗?jié)兊榷喾N作用。2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定正品黨參為桔?？浦参稂h參Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.、素花黨參CodonopsispilosulaNannf. var.modesta(Nannf.)L.T.Shen和川黨參CodonopisistangshenOliv.的干燥根[1]，這3種黨參種子均屬小粒種子，大小、形狀、顏色極其相近[2]。在生產(chǎn)中，這3種種子極易混淆，給黨參生產(chǎn)和正確評(píng)定種子等級(jí)帶來(lái)很大麻煩。本研究采用種子蛋白的SDS-PAGE電泳，子葉蛋白的SDS-PAGE電泳，和子葉蛋白的非變性凝膠電泳3種不同的方法對(duì)黨參種子真實(shí)性進(jìn)行研究，得出最適合黨參種子真實(shí)性鑒定所用的方法，從而為黨參種子品種鑒定以及黨參種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供重要依據(jù)。

1 材料

1.1 種子來(lái)源

分別于2012年11月份在山西，四川，甘肅，陜西共收集栽培種子6份，材料來(lái)源及其編號(hào)見(jiàn)表1。

表1 種子來(lái)源及編號(hào)

依據(jù)文獻(xiàn)和植物志對(duì)黨參屬植物的形態(tài)分類以及各種質(zhì)的外部形態(tài)特征，鑒定27號(hào)(山西平順縣東寺頭鄉(xiāng)焦底村，以下簡(jiǎn)稱山西平順)、36號(hào)(甘肅岷縣梅川鎮(zhèn)底固村，以下簡(jiǎn)稱甘肅岷縣)及43號(hào)(甘肅臨洮縣玉井鎮(zhèn)陳家嘴村上街，以下簡(jiǎn)稱甘肅臨洮)為黨參；44號(hào)(四川阿壩小金縣，以下簡(jiǎn)稱四川野生)為野生川黨參；A(陜西鳳縣)，B(甘肅文縣)為素花黨參。

1.2 儀器

電泳儀，酶標(biāo)儀，移液槍，染色搖床，脫色搖床，研缽，低溫離心機(jī)等

1.3 試劑

(1)提取液的配制：1 mol·L-1Tris-HCl(PH 7.6)/500 μL；5 mol·L-1NaCl/200 μL；10%Np40/100 μL；30%甘油/3.33 μL；1mmol·L-1DTT/13.5 μL；Protain Inhibitor(羅氏生產(chǎn))/100 μL；雙蒸H2O/5.4 mL.

(2)10%分離膠：重蒸H2O/5.9 mL；30%Acr-Bis(29∶1)(Bio-Rad)/5.0mL；1.5 mol·L-1Tris-HCl(PH 8.8)/3.8 mL；10%SDS/150μL；10%過(guò)硫酸銨/150 μL；TEMED/6 μL.

(3)5%濃縮膠5 mL：重蒸H2O/5 mL；30%Acr-Bis(29∶1)(Bio-Rad)/3.4 mL；1.0 mol·L-1Tris-HCl(PH 6.8)/830 μL；10%SDS/50 μL；10%過(guò)硫酸銨/50 μL；TEMED/5μL.

(4)電極緩沖液：Tris 3.03 g，甘氨酸14.4 g，SDS 1.0 g，溶于H2O中，定容至1 000 mL。

(5)上樣緩沖液：250 mmol·L-1Tris-HCl，10%SDS，0.5%溴酚藍(lán)，50%甘油，375 mmol·L-1DTT。

(6)染色液：45%甲醇，10%乙酸，0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250

(7)脫色液：25%甲醇，10%乙酸

(8)Marker蛋白(康為試劑)

2 方法與結(jié)果

2.1 種子全蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳

2.1.1 樣品制備：用液氮快速磨碎種子，將種子粉末加在樣品管內(nèi)后，放入100 μL提取液，置于冰上30 min。然后將樣品管于4 ℃的低溫離心機(jī)中，以13000 r/min的速度離心15 min，直至提取液沒(méi)有渾濁取上清，將樣品提取液在100 ℃下變性5 min，并經(jīng)酶標(biāo)儀定量使其濃度達(dá)到7.5 μg·μL-1。

2.1.2 電泳操作：按上樣緩沖液：上清液(1∶5)的比例，在樣品管中加入適量緩沖液。然后用微量上樣器吸取樣品20 μL，Marker蛋白5 μL，注入樣品槽。最后加入電極緩沖液開(kāi)始電泳，開(kāi)始電壓為80V，待樣品進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至120V，待指示劑行至距離底部0.5～1 cm時(shí)，關(guān)閉電源，停止電泳。

2.1.3 染色與脫色：將膠板浸于考馬斯亮藍(lán)R250染色液中染色1～2 h，至譜帶清晰。染色后用水沖去凝膠表面附著的染料，用脫色液脫色，直至背景清晰。

2.1.4 重現(xiàn)性：同樣的試驗(yàn)重復(fù)5次，其電泳結(jié)果如圖1。

注：圖中由左至右依次為，27(山西平順)，36(甘肅岷縣)，A(陜西鳳縣，B(甘肅文縣)，44(四川野生)，43(甘肅臨洮)以及Marker。圖1 種子蛋白SDS-PAGE電泳圖譜

2.1.5 結(jié)果分析：不同黨參種子間的差異主要體現(xiàn)在譜帶數(shù)和泳動(dòng)率上。泳動(dòng)率(Rf)公式：Rf=樣品譜帶泳動(dòng)距離∕溴酚藍(lán)前沿泳動(dòng)距離(見(jiàn)表2)。

表2 樣品泳動(dòng)率

注：“—”表示沒(méi)有譜帶。

通過(guò)5次重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)每次試驗(yàn)均是A(陜西鳳縣)，B(甘肅文縣)，44號(hào)(四川野生)，比別的地方的黨參多出一條Rf值大約為0.060的譜帶，根據(jù)旁邊的Marker蛋白譜帶可以初步推斷這個(gè)差異蛋白的分子量在170 KDa左右，而且44號(hào)(四川野生)這條譜帶要比其他兩個(gè)種子的顏色要深。根據(jù)親緣關(guān)系較近的種，遺傳物質(zhì)分歧不大，其蛋白質(zhì)組成就愈相近[3-4]的道理，推斷44號(hào)、A及B這3類種子親緣關(guān)系更近。根據(jù)譜帶越多，品系越進(jìn)化，適應(yīng)環(huán)境能力越強(qiáng)，可以推斷這3類種子適應(yīng)環(huán)境能力較強(qiáng)。

2.2 子葉中蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳

將種子于溫度20 ℃，光照2 400 lx，紙床條件下，培養(yǎng)16天，剪下剛萌發(fā)的幼嫩子葉，放入液氮迅速磨碎，加入樣品提取液，通過(guò)高速離心從中提取樣品蛋白。經(jīng)酶標(biāo)儀定量，使其樣品濃度達(dá)到7.5 μg·μL-1后經(jīng)過(guò)電泳，染色，脫色，5次重復(fù)性試驗(yàn)(步驟和方法同2.1項(xiàng)下)，最后得到電泳結(jié)果見(jiàn)圖2，經(jīng)計(jì)算，其樣品泳動(dòng)率見(jiàn)表3。

注：圖中由左至右依次為，27號(hào)(山西平順)，44號(hào)(四川野生)，A(陜西鳳縣)，36號(hào)(甘肅岷縣)，B(甘肅文縣)，Marker。圖2 子葉蛋白SDS-PAGE電泳圖

譜帶號(hào)2744A36B10.4930.4940.4920.4930.49320.5340.534—0.5350.53430.5610.562—0.5630.562

注：“—”表示沒(méi)有譜帶。

子葉中蛋白質(zhì)電泳圖沒(méi)有種子蛋白質(zhì)電泳圖清晰，可能由于種子中蛋白質(zhì)表達(dá)量更高，經(jīng)過(guò)5次重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)A(陜西鳳縣)沒(méi)有第2，3條譜帶，通過(guò)Marker對(duì)比得到，它與其他種黨參的差異蛋白分子量介于55 KDa～43 KDa之間。

2.3 子葉中蛋白質(zhì)的非變性凝膠電泳

其樣品蛋白也是來(lái)源于剛萌發(fā)的幼嫩子葉。經(jīng)過(guò)酶標(biāo)儀定量使其濃度達(dá)到7.5 μg/μL，樣品蛋白提出來(lái)之后去除高溫變性的步驟。在配制濃縮膠，分離膠，上樣緩沖液，和電極液時(shí)，分別去除里面的SDS成分。樣品經(jīng)過(guò)電泳，染色，脫色，5次重復(fù)性試驗(yàn)之后，得到的電泳結(jié)果見(jiàn)圖3，經(jīng)計(jì)算，其樣品泳動(dòng)率見(jiàn)表4。

注：圖中由左至右依次為，27號(hào)(山西平順)，44號(hào)(四川野生)，A(陜西鳳縣)，36(甘肅岷縣)，B(甘肅文縣)，Marker。圖3 子葉蛋白的非變性凝膠電泳

譜帶號(hào)2744A36B10.1200.1210.1200.1220.12020.1520.1510.1540.1520.15330.2070.2080.2070.2060.20740.2930.2940.2950.2940.29350.5330.5340.5330.5350.533

從子葉蛋白的非變性凝膠電泳來(lái)看，各地種子在圖譜上并沒(méi)有出現(xiàn)差異性，可能的原因是，膠版不夠大，以至于蛋白質(zhì)沒(méi)有完全分開(kāi)。

3 討論

真實(shí)性鑒定是種子生產(chǎn)工作中不可缺少的重要步驟，是保證良種優(yōu)良遺傳性充分發(fā)揮，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)持續(xù)穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的有效措施；是正確評(píng)定種子等級(jí)，貫徹優(yōu)種優(yōu)價(jià)政策的主要依據(jù)[5-7]。蛋白質(zhì)電泳鑒定是種子真實(shí)性鑒定的一種常用的方法，其理論依據(jù)是蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)基因編碼的標(biāo)記，通過(guò)分析足夠多的蛋白質(zhì)標(biāo)記就可以涉及大量的基因組[8-9]。植物品種是由各種不同遺傳表現(xiàn)的種質(zhì)集合體組成，所以對(duì)這些集合體中的蛋白質(zhì)或酶進(jìn)行比較，就能用來(lái)描述這些材料的特征。而電泳正好提供了一種進(jìn)行這種比較的絕好方法[10]。

本文對(duì)3種不同的蛋白質(zhì)電泳方法進(jìn)行研究，結(jié)果表明：種子蛋白的SDS-PAGE電泳譜帶清晰，分離到的差異譜帶多；子葉蛋白的SDS-PAGE電泳譜帶模糊；子葉蛋白的PAGE電泳譜帶雖然清晰，但是沒(méi)有分離到有差異的譜帶。綜合以上分析，建議選擇種子蛋白的SDS-PAGE電泳作為黨參真實(shí)性鑒別的方法。

通過(guò)種子蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜分析得到：A(陜西鳳縣)，B(甘肅文縣)及44號(hào)(四川野生)的親緣關(guān)系比較近，它們差異蛋白的分子量在170 KDa左右。

種子蛋白的SDS-PAGE電泳方法操作簡(jiǎn)單，效率高，可以用作黨參種子真實(shí)性鑒別的方法，為減少生產(chǎn)中品種混雜，并為黨參種子品種鑒定以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供重要依據(jù)。

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Study on Seed Genuineness Identification of Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf

SU Ningning，ZHANG Liping*

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，PeikingUnionMecicalCollege；KeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine，MinistryofEducation，Beijing100193，China)

Objective：To provide the basis for variety identification and seed standards ofCodonopsispilosula(Franch.)Nannf through researching seeds genuineness identification methods.Methods：Codonopsispilosulaseeds protain SDS-PAGE electrophoresis，cotyledonary protain SDS-PAGE electrophoresis and cotyledonary protain PAGE electrophoresis from different area were analyzed.Results：The results of three different electrophoresis methods displayed：the bands of seeds protain SDS-PAGE electrophoresis were clearness and the different bands isolated from electrophoresis were much more.The bands of cotyledonary protain SDS-PAGE electrophoresis were fuzzy.Though the bands of cotyledonary protain PAGE electrophoresis were very clearness，there was no difference band isolated from the way of electrophoresis.Conclusion：Seeds’ protain SDS-PAGE electrophoresis was chose to verify the genuineness ofCodonopsispilosula.The genetic relationship among seeds from Fengxian in Shanxi，Wenxian in Gansu and Aba in Sichuan provinces were close.The molecular weight of distinct protein was 170 KDa.

Codonopsispilosula(Franch.)Nannf；Genuineness identification；Electrophoresis

國(guó)家科技重大專項(xiàng)中藥材種子種苗和種植標(biāo)準(zhǔn)平臺(tái)(2012ZX09304006)

*[通信作者] 張麗萍，研究員，研究方向：中藥材規(guī)范化種植，Tel：(010)62899743，E-mail：LPzhang@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.01.008

2013-05-12)