熱薩萊提·伊敏，買買提·吐爾遜，塔伊爾·麥孜尼

(喀什師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)系，新疆 喀什 844100)

HPLC同時(shí)測(cè)定新疆少花龍葵中綠原酸和蘆丁的含量

熱薩萊提·伊敏*，買買提·吐爾遜，塔伊爾·麥孜尼

(喀什師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)系，新疆 喀什 844100)

目的：采用超聲波提取，建立同時(shí)測(cè)定新疆少花龍葵中綠原酸和蘆丁含量的高效液相色譜法。方法：色譜柱為安捷倫HC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸(50∶ 50)；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.00 mL·min-1，低壓梯度洗脫。結(jié)果：綠原酸和蘆丁質(zhì)量濃度分別在6.25～150 μg·mL-1(r=0.999 8)和6.25～150 μg·mL-1(r=0.999 9)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為100.2%(RSD=1.3%，n=5)和100.9%(RSD=1.4%，n=5)。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便快速、重復(fù)性好、準(zhǔn)確、可靠，適用于同時(shí)測(cè)定新少花龍葵中綠原酸和蘆丁含量。

新疆少花龍葵；高效液相色譜法；綠原酸；蘆丁

少花龍葵SolanumnigrumL.var.PauciflorumLiou別名野辣椒、白花菜、烏點(diǎn)規(guī)等，為茄科1年生草本植物，生長(zhǎng)于路旁、山野、荒地、埔園、密林、溪邊等陰濕地。龍葵中紅果龍葵是提取紅色素的原料之一，少花龍葵果實(shí)是提取褐、藍(lán)染料的最佳原料[1]。少花龍葵味微苦、甘，性寒，含有酚類、鞣質(zhì)、生物堿、萜類內(nèi)酯、糖及其苷類、氨基酸、蛋白質(zhì)、皂苷和生物堿等化學(xué)成分[2]，是維吾爾醫(yī)學(xué)中特別重要的藥材，具有解熱、止血、消腫拔毒功能，對(duì)牙齦出血、眼疾、呼吸道疾病、高血壓病、肺熱咳嗽、痢疾、扁桃體炎、黃疸肺熱咳嗽等[3-4]有一定療效。

關(guān)于少花龍葵中黃酮類化合物的提取工藝和抗氧化性研究已有報(bào)道[5]，但對(duì)其黃酮具體有效成分的定量分析未見任何報(bào)道。筆者研究了超聲波提取、HPLC測(cè)定新疆少花龍葵中綠原酸和蘆丁的含量，為少花龍葵的開發(fā)、藥用有效成分提取研究提供一定參考。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀(配有SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，DGU-20A5在線脫氣機(jī)，LC-solution工作站)；KQ3200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XA-1型多功能粉碎機(jī)(江蘇姜堰市分析儀器廠)；ZK-82B真空干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)；賽多利斯BS224S型電子天平(德國(guó))。

綠原酸對(duì)照品、蘆丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為0753-200111，0080-9705)；甲醇、乙腈為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。

少花龍葵采集于新疆疏附縣鐵日木鄉(xiāng)，經(jīng)喀什師范學(xué)院生地系司馬義·把拉提教授鑒定為正品，用蒸餾水洗凈，自然曬干，真空干燥箱烘干12 h(50 ℃)，藥材粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，裝試劑瓶備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫HC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸(50∶ 50)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別準(zhǔn)確稱取真空干燥至恒重的綠原酸及蘆丁對(duì)照品各5.0 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇完全溶解，稀釋并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為200 μg·mL-1的綠原酸和蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。使用時(shí)可以根據(jù)所需要的濃度混合并稀釋。

混合對(duì)照品溶液的配制：分別準(zhǔn)確吸取不同體積綠原酸及蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液于7個(gè)10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，在冰箱里保存(6 ℃)。7組混合對(duì)照品溶液中綠原酸、蘆丁的質(zhì)量濃度分別為6.25，12.5，25，50，100，150，200 μg·mL-1。

2.3 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取干燥、粉碎、過60目篩的新疆少花龍葵粉末1.0 g，加75%甲醇25 mL，超聲提取30 min，浸泡3 h，超聲30 min，抽濾除渣，50 ℃減壓濃縮濾液至干，放置室溫，用甲醇定容至25 mL，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液置于冰箱備用。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取綠原酸、蘆丁質(zhì)量濃度分別為6.25，12.5，25，50，100，150 μg·mL-1混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，按2.1色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。分別以對(duì)照品的質(zhì)量濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程和線性范圍，綠原酸的線性范圍為6.25～150 μg·mL-1，回歸方程為Y=5 065.8X+6 473.7，r=0.999 8；蘆丁的線性范圍為6.25～150 μg·mL-1，回歸方程為Y=16 432.8X-8 250.8，r=0.999 9。色譜圖見圖1。

1.綠原酸 2.蘆丁 A.混合對(duì)照品 B.供試品圖3 少花龍葵及對(duì)照品HPLC圖

2.5 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，在2.1色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定綠原酸和蘆丁峰面積的RSD分別為1.33%，0.98%(n=5)，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一新疆少花龍葵樣品5份，每份約1.0 g，按2.3方法制備樣品溶液，計(jì)算樣品中綠原酸與蘆丁平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.06%和0.015%，RSD分別為1.75%和2.13%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品溶液，分別放置0，4，8，12，16，20，48 h后，在2.1色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。計(jì)算得綠原酸峰面積的RSD=1.95%，蘆丁峰面積的RSD=2.25%，結(jié)果表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知綠原酸、蘆丁含量的少花龍葵樣品5份，分別添加不同量的綠原酸、蘆丁對(duì)照品溶液，按2.3制備樣品溶液，按2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 少花龍葵中綠原酸及蘆丁加樣回收率試驗(yàn)

2.9 樣品含量測(cè)定

精密吸取少花龍葵樣品溶液10 μL進(jìn)樣，并按2.1色譜條件進(jìn)行5次平行測(cè)定，計(jì)算樣品中綠原酸和蘆丁的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果分別為598.8，150.7 μg·g-1。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

從二極管陣列檢測(cè)器采集的樣品三維圖譜中提取紫外光譜和不同波長(zhǎng)的色譜進(jìn)行對(duì)比，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm時(shí)色譜峰的峰形對(duì)稱，達(dá)到定量分析要求，并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[6]確定360 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

考察了不同比例的甲醇-乙酸，甲醇-0.1%磷酸，甲醇-0.4%磷酸，乙腈-磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)樣品中各個(gè)有效成分的分離情況，當(dāng)以甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶ 50)作為流動(dòng)相時(shí)，綠原酸、蘆丁峰形良好，能達(dá)到基線分離，并且與其他雜質(zhì)峰得到了良好的分離，峰形良好。因此，確定甲醇-0.4%磷酸(50∶ 50)為流動(dòng)相。

3.3 提取方法及溶液的選擇

考察了75%甲醇(乙醇)回流法、75%甲醇(乙醇)超聲波提取法、75%甲醇(乙醇)浸泡法(24 h)，結(jié)果表明，用75%甲醇超聲提取30 min，浸泡3 h，再超聲提取30 min的方法，綠原酸和蘆丁的提取率達(dá)到最高。超聲提取操作具有簡(jiǎn)單易行、能耗低、快速高效、不破壞有效成分等特點(diǎn)，故選擇超聲提取30 min，浸泡3 h，再超聲提取30 min作為新疆少花龍葵中有效成分的提取方法。

3.4 研究方法評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)建立了以75%甲醇為提取劑的超聲波提取，提取液經(jīng)有機(jī)微孔濾膜(0.45 μm)過濾，HPLC同時(shí)測(cè)定新疆少花龍葵中綠原酸和蘆丁含量的定量分析方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，綠原酸和蘆丁分別在6.25～150 μg·mL-1和6.25～150 μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為100.2%(RSD=1.3%，n=5)和100.9%(RSD=1.4%，n=5)。該方法簡(jiǎn)便快速、重復(fù)性好、準(zhǔn)確可靠，適用于同時(shí)測(cè)定少花龍葵中綠原酸和蘆丁的含量。研究為新疆少花龍葵資源的深度開發(fā)利用、藥用價(jià)值研究以及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] 李容，張婧萱，廖保寧，等.超聲波提取少花龍葵總黃酮及鑒別方法[J].中國(guó)處方藥，2012，(2)：46-48.

[2] 段志芳，黃麗華.少花龍葵化學(xué)成分預(yù)試及抑制亞硝化反應(yīng)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(8)：1992-1994.

[3] 鄧女銘，黃松，蘇青，等.少花龍葵的生藥研究[J].廣西中醫(yī)藥，1999，22(5)：44.

[4] 徐淑元，孫懷志，譚雪.保健野生蔬菜——少花龍葵的栽培技術(shù)[J].廣西園藝，2002，(4)：30-31.

[5] 賢景春，吳偉軍.少花龍葵莖總黃酮提取工藝及其抗氧化性研究[J].廣西植物，2012，32(4)：567-570.

[6] 郭炬亮，李新霞，支玲.HPLC測(cè)定糙枝金絲桃中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山奈酚[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(11)：75-78.

HPLCDeterminationofChlorogenicAcidandRutinContentsinXinjiangSolanumnigrumL.var.PauciflorumLiou

EMIN Resalat*，TURSON Mamat，MAZIN Tahir

(DepartmentofChemistryandEnvironmentalScience，KashigarTeacher’sCollege，Kashigar844100，China)

The content of Chlorogenic acid and Rutin in XinjiangSolanumnigrumL.var.PauciflorumLiou was determined by RP-HPLC with Agilent HC-C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase was CH3OH and 0.4% H3PO4(50∶ 50)with flow rate of 1.0 mL min-1，the detection wave length was 360 nm.There was a linear correlation between the concentration of chlorogenic acid(6.25-150 μg·mL-1，r=0.999 8)and rutin(6.25-150 μg·mL-1，r=0.999 9).The average recovery of chlorogenic acid and rutin was 100.2%(RSD=1.3%，n=5)and 100.9%(RSD=1.4%，n=5)，respectively.The method is simple，rapid，reproducible，accurate and reliable.It could be used to identify and evaluate the quantitative determination of chlorogenic acid and rutin content of XinjiangSolanumnigrumL.var.PauciflorumLiou.

SolanumnigrumL.var.PauciflorumLiou；HPLC；Chlorogenic acid；Rutin

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.11.007

2014-05-13)

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熱薩萊提·伊敏，助教，研究方向：天然產(chǎn)物；E-mail：resalatuyghur@163.com