劉萍萍,李倩如△,軒小燕,董子明,王 哲,杜 英
(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院:1.微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室;2.病理生理學(xué)教研室,鄭州 450001;3.河南省疾病控制中心性病艾滋病研究所,鄭州 450016)
獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)即艾滋病是由人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)引起的免疫缺陷型疾病,導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行性減少,機(jī)體免疫功能缺失,最終引起機(jī)體各種機(jī)會(huì)性感染和腫瘤以致死亡。機(jī)體感染HIV后發(fā)展為AIDS的過(guò)程可大致分為3個(gè)階段:急性感染期、無(wú)癥狀期、AIDS期。目前,對(duì)AIDS的預(yù)防尚缺乏有效的特異性疫苗,世界普遍公認(rèn)的有效治療手段是高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly active antiretroviral therapy,HAART),但對(duì)無(wú)癥狀 HIV感染者,因尚未達(dá)到HAART療法應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn),現(xiàn)無(wú)合適藥物可用。若任病情逐漸進(jìn)展,不利于疾病的早期控制。基于此種原因,充分發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì),對(duì)無(wú)癥狀HIV感染者進(jìn)行中醫(yī)藥早期干預(yù)治療,以延緩感染者發(fā)病進(jìn)程,提高感染者生存質(zhì)量,具有重大現(xiàn)實(shí)意義。益艾康膠囊由人參、黃芪等多種中藥組成,具有健脾補(bǔ)胃,益氣養(yǎng)血、化痰解毒之功效,能增加機(jī)體免疫功能。故本研究通過(guò)檢測(cè)HIV早期無(wú)癥狀感染者經(jīng)益艾康膠囊干預(yù)治療后CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群的表達(dá),探討益艾康藥物對(duì)T細(xì)胞亞群功能的影響,試圖尋找到能準(zhǔn)確、敏感反映病情進(jìn)展和藥物療效的指標(biāo)。
1.1 一般資料 60例無(wú)癥狀HIV感染者(HIV抗體陽(yáng)性、并經(jīng)確認(rèn)試驗(yàn)證實(shí),CD4+T細(xì)胞介于200~500個(gè)/μL之間,僅表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫大,未出現(xiàn)機(jī)會(huì)感染和腫瘤),其中,男34例,女26例,年齡35~45歲,均系河南確山縣及尉氏縣經(jīng)有償獻(xiàn)血感染者。將上述60例感染者隨機(jī)分為兩組:益艾康干預(yù)組30例,接受益艾康膠囊干預(yù)治療6個(gè)月;對(duì)照組30例,未接受任何抗病毒治療。益艾康膠囊主要藥物組成:人參、黃芪、炒白術(shù)、茯苓、當(dāng)歸、川芎、白芍、黃芩等。由河南省中醫(yī)藥研究院研制,規(guī)格:0.5g/粒,60粒/瓶,每次3.0g,每日3次。
1.2 主要試劑和儀器 10mL乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝負(fù)壓真空采血管、免洗溶血?jiǎng)D4/CD8/CD3三色單抗標(biāo)記試劑盒,F(xiàn)ITC-CD4、FITC-CD8、PE-CD45RA、PE-CD45RO、PECD95、PE-CD28和PE-CD38單抗及同型對(duì)照抗體、流式細(xì)胞儀FASCAN,均為Becton Dicknson公司產(chǎn)品。
1.3 標(biāo)本采集 用10mL EDTA抗凝真空負(fù)壓采血管采集受試者靜脈血5mL,4℃冷藏保存運(yùn)輸。
1.4 細(xì)胞絕對(duì)值計(jì)數(shù) 將20μL CD4/CD8/CD3三色單抗加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中,加入50μL抗凝全血,室溫避光15min,加入免洗溶血素450μL室溫避光15min,流式細(xì)胞儀檢測(cè),F(xiàn)ACSMULTISET軟件自動(dòng)分析,得到CD4+、CD8+、CD3+淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、百分比及CD4/CD8比值。
1.5 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 取5mL抗凝靜脈血加入紅細(xì)胞裂解液2mL,振蕩混勻后繼續(xù)孵育15min,1 500r/min離心5 min收集細(xì)胞,用PBS溶液洗2次,去上清液,再重懸于PBS溶液中,取100μL細(xì)胞懸液,加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體各5 μL,室溫避光孵育30min,離心后棄上清液,每管加0.5mL PBS液,上流式細(xì)胞儀檢測(cè),每管收集5 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 益艾康膠囊治療前、后病毒載量變化情況 益艾康干預(yù)組干預(yù)后感染者病毒載量與藥物干預(yù)前相比有所下降(P<0.05),見(jiàn)表1。
2.2 益艾康膠囊干預(yù)對(duì)外周血CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的影響益艾康干預(yù)前,干預(yù)組和對(duì)照組CD4計(jì)數(shù)經(jīng)t檢驗(yàn),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);干預(yù)6個(gè)月后干預(yù)組CD4計(jì)數(shù)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。無(wú)癥狀HIV感染者接受益艾康膠囊干預(yù)后外周血CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD4+CD28+、CD4+CD95+細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。
表1 益艾康膠囊干預(yù)前、后兩組患者病毒載量比較±s)
表1 益艾康膠囊干預(yù)前、后兩組患者病毒載量比較±s)
*:P<0.05,與干預(yù)組干預(yù)前比較。
病毒載量(log 10copy/mL)組別干預(yù)前 干預(yù)后干預(yù)組 4.55±1.25 3.47±0.79*對(duì)照組4.37±0.87 4.78±1.14
表2 兩組患者干預(yù)前、后CD4計(jì)數(shù)比較±s,個(gè)/μL)
表2 兩組患者干預(yù)前、后CD4計(jì)數(shù)比較±s,個(gè)/μL)
*:P<0.05,與對(duì)照組干預(yù)后比較。
時(shí)間 干預(yù)組 對(duì)照組干預(yù)前437.64±64.12 431.25±65.67干預(yù)后 546.23±87.65*406.48±75.81
表3 兩組患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞亞群比例比較[s),%]
表3 兩組患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞亞群比例比較[s),%]
*:P<0.05,與對(duì)照組比較。
組別 CD4+ CD4+CD45RA+ CD4+CD45RO+ CD4+CD28+ CD4+CD95+干預(yù)組 25.81±3.21* 9.21±1.24* 12.69±2.53* 12.05±2.67* 17.41±3.08*對(duì)照組 13.43±1.85 4.17±0.87 9.80±2.14 9.04±1.78 8.56±1.74
2.3 益艾康膠囊干預(yù)對(duì)外周血CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的影響
益艾康膠囊干預(yù)組CD8+、CD8+CD38+T細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組(P<0.05);而兩組CD8+CD95+T細(xì)胞比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表4。
表4 兩組患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞亞群比例比較±s),%]
表4 兩組患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞亞群比例比較±s),%]
*:P<0.05,與對(duì)照組比較。
組別 CD8+ CD8+CD38+ CD8+CD95+干預(yù)組 50.90±5.67* 40.52±4.23*41.18±4.17對(duì)照組64.48±5.81 57.15±4.79 42.50±3.84
AIDS是由HIV感染引起的以細(xì)胞免疫缺陷為主的繼發(fā)性免疫缺陷病。HIV感染屬慢發(fā)病毒感染,一般有較長(zhǎng)潛伏期。但是,一旦發(fā)病,疾病往往呈進(jìn)行性加重。目前,HAART療法主要是針對(duì)AIDS期患者,而HIV感染后的無(wú)癥狀期持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),感染者數(shù)量最多。根據(jù)中醫(yī)學(xué)“未病先防、既病防變”的學(xué)術(shù)思想,可把無(wú)癥狀期作為中醫(yī)藥治療AIDS的切入點(diǎn),對(duì)此期感染者進(jìn)行免疫學(xué)和病毒學(xué)指標(biāo)的監(jiān)控,有利于及時(shí)了解病情并采取相應(yīng)的治療方案,控制疾病進(jìn)展[1-2]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外對(duì)于中醫(yī)藥治療艾滋病進(jìn)行了多方面探索,中醫(yī)藥在改善臨床癥狀、減輕病痛、延緩病情進(jìn)展、維護(hù)免疫功能的穩(wěn)定、減輕西醫(yī)聯(lián)合抗病毒治療藥物的毒副作用等方面展現(xiàn)出較大的優(yōu)勢(shì)[3],但其機(jī)制多不明了。
外周血CD4細(xì)胞的絕對(duì)值對(duì)于HIV感染狀況、臨床分期、預(yù)測(cè)機(jī)會(huì)性感染的可能性和治療效果的評(píng)價(jià)具有極其重要的作用[4]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)益艾康膠囊干預(yù)6個(gè)月后,患者CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值上升,與干預(yù)前相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且與對(duì)照組相比CD4+T的百分率顯著提高,提示HIV感染無(wú)癥狀期服用益艾康膠囊可以明顯穩(wěn)定或減緩CD4+T淋巴細(xì)胞的下降幅度,促進(jìn)免疫功能重建,同時(shí)通過(guò)抑制病毒復(fù)制或其他作用途徑,降低或穩(wěn)定病毒載量。
外周循環(huán)CD4+T細(xì)胞主要有兩類(lèi):幼稚細(xì)胞(CD45RA+T)和記憶細(xì)胞(CD45RO+T),HIV感染后,無(wú)論是未經(jīng)抗原刺激的幼稚細(xì)胞,還是接觸過(guò)抗原刺激的記憶細(xì)胞都不斷減少[5]。本研究結(jié)果顯示,益艾康膠囊干預(yù)后,CD45RA+T細(xì)胞和CD45RO+T百分比與對(duì)照組相比均顯著升高(P<0.05)。同時(shí)觀(guān)察到CD4+CD28+T和CD4+CD95+T的比例均較對(duì)照組升高(P<0.05)。CD28和CD95分別是T細(xì)胞表面的共刺激分子和細(xì)胞凋亡分子,與CD25分子一樣,能在一定程度上反映CD4+T細(xì)胞的活化、凋亡及其功能狀態(tài)[6-7],說(shuō)明活化T細(xì)胞下降幅度減緩,提示益艾康膠囊干預(yù)能提高CD4+T細(xì)胞的輸出和促進(jìn)其活化,有助于恢復(fù)HIV感染者的免疫功能,有利于免疫重建。
CD8+T淋巴細(xì)胞是特異性細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞,能通過(guò)特異性識(shí)別病毒感染的靶細(xì)胞,并對(duì)其產(chǎn)生殺傷作用,是機(jī)體內(nèi)直接殺傷 HIV病毒的主要免疫細(xì)胞[8]。CD8+CD38+T細(xì)胞是一群激活的亞群,在HIV感染時(shí)能發(fā)生擴(kuò)增,是評(píng)價(jià)HIV感染者免疫激活的又一指標(biāo)[9],本研究顯示益艾康干預(yù)6個(gè)月后,CD8+T細(xì)胞百分比減少的同時(shí),CD8+CD38+T細(xì)胞百分比也下降,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示通過(guò)益艾康膠囊干預(yù)可以使HIV感染者異常的免疫激活得到抑制。
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