葛暢 許春偉 王魯平 方園 張玉萍

[摘要] 目的 探討甲基化酶抑制劑5'-氮雜-2'-脫氧胞苷（5'-Aza-2'-deoxycytidine，5'-Aza-CdR）對結(jié)直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因甲基化水平及蛋白表達的影響。 方法 用不同濃度（0.5、1.0、1.5 μmol/L）5'-Aza-CdR處理結(jié)直腸癌細胞株HT-29和LoVo。應(yīng)用TaqMan探針為基礎(chǔ)的實時定量PCR（Methylight）方法、SYBR Green PCR方法及蛋白印跡實驗（Western blot）檢測藥物處理前后HT-29和LoVo細胞中Wif-1基因的甲基化狀態(tài)、mRNA和蛋白表達。 結(jié)果 Methylight檢測HT-29和LoVo細胞中Wif-1蛋白在藥物作用后異常甲基化得到逆轉(zhuǎn)；實時熒光定量PCR和Western Blot檢測到0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR處理后Wif-1基因mRNA和蛋白重新表達，實時熒光定量PCR檢測DMSO對照組和不同濃度5'-Aza-CdR（0.5、1.0、1.5 μmol/L）在HT-29細胞株相對表達量分別為（1.000±0.000）、（1.207±0.052）、（1.790±0.033）和（2.016±0.123）；在LoVo細胞株相對表達量分別為（1.000±0.000）、（1.294±0.048）、（1.893±0.061）和（2.204±0.041）。Western blot檢測Wif-1蛋白檢測DMSO對照組和不同濃度5'-Aza-CdR在HT-29細胞株相對表達量分別為（0.456±0.040）、（0.511±0.025）、（0.857±0.031）和（0.934±0.047）；LoVo細胞株相對表達量分別為（0.842±0.032）、（0.844±0.044）、（0.854±0.037）和（0.856±0.034）。以上作用均呈時間、劑量依賴性，Wif-1基因mRNA在HT-29細胞株表達和LoVo細胞株表達差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（F=144.823，P=0.000；F=476.195，P=0.000）。Wif-1蛋白表達在HT-29細胞株表達差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（F=129.674，P=0.000），但Wif-1蛋白表達在LoVo細胞株表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.117，P=0.948）。 結(jié)論 結(jié)直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1啟動子甲基化可能是導(dǎo)致該基因表達下調(diào)甚至失活的主要原因。5'-Aza-CdR能夠較成功地逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因的甲基化狀態(tài)，并能恢復(fù)mRNA及蛋白重新表達。

[關(guān)鍵詞] DNA甲基化；5'-Aza-CdR；HT-29；LoVo；Wif-1基因

[中圖分類號] R735.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）08（b）-0016-06

Effect of 5-Aza-dC on mRNA expression， protein expression and methylation of Wif-1 gene status in HT-29 and LoVo Colorectal cancer

GE Chang XU Chunwei WANG Luping FANG Yuan ZHANG Yuping

Department of Pathology， the Military General Hospital of Beijing PLA， Beijing 100700， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine （5-Aza-dC）， a methylation inhibitor， on the mRNA expression， protein expression of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines. Methods HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines was treated with different dosages of 5-Aza-dC. Wif-1 gene DNA， mRNA and protein were determined by Methylight， SYBR Green PCR and Western blot respectively. HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines were treated with different dosages of 5-Aza-dC （0.5， 1.0， 1.5 μmol/L）. Wif-1 gene DNA， mRNA and protein were determined by Methylight， SYBR Green PCR and Western blot respectively. Results Methylight detection showed that the Wif-1 gene methylation had effectively been reverserd by 5-Aza-dC. Moreover， the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-dC increased respectively in HT-29 Colorectal cell line[（1.000±0.000）， （1.207±0.052）， （1.790±0.033）， （2.016±0.123）]， and the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-Dc increased respectively in LoVo Colorectal cell line [（1.000±0.000）， （1.294±0.048）， （1.893±0.061）， （2.204±0.041）]. Western blot indicated that 5-Aza-dC could recover the Wif-1 protein expression respectively in HT-29 Colorectal cell line [（0.456±0.040）， （0.511±0.025）， （0.857±0.031）， （0.934±0.047）]， and the protein expression was （0.842±0.032）， （0.844±0.044）， （0.854±0.037）， （0.856±0.034）， respectively in LoVo Colorectal cell line. The Wif-1 gene mRNA effects within certain extent dose and time dependent with statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line （F=144.823， P=0.000） and LoVo Colorectal cancer line （F=476.195， P=0.000）， and the Wif-1 protein effects within certain extent dose and time dependent with statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line （F=129.674， P=0.000）， but without statistical significance in LoVo Colorectal cancer line （F=0.117， P=0.948）. Conclusion The methylation of promoter region is a main cause for transcriptional inactivation of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines. 5-Aza-dC may effectively reactivate the gene transcription through a demethylation role.

[Key words] DNA methylation； 5-Aza-dC； HT-29； LoVo； Wif-1 gene

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）作為最常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅位于肺癌和前列腺癌（女性為乳腺癌）之后，居第3位，而每年CRC病死率約占全部惡性腫瘤死亡總?cè)藬?shù)的8%，在惡性腫瘤死因中居第4位[1]。CRC的發(fā)生與發(fā)展與癌基因和抑癌基因的缺失、擴增或突變有關(guān)。有些基因在染色質(zhì)水平上發(fā)生表型遺傳修飾改變也會導(dǎo)致表達下調(diào)。表型遺傳修飾最多見的是CpG島（CpG island）的甲基化改變。Wif-1基因（Wnt inhibitory factor-1）定位于人類染色體12q14.3上，由10個外顯子組成，全長約200 kb。Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路是調(diào)控細胞生長增殖的重要途徑之一，其異常激活已發(fā)現(xiàn)與多種人類腫瘤密切相關(guān)[2]。Wif-1基因是這條通路的下游區(qū)基因也是這條通路的拮抗基因。Wif-1基因的高甲基化在多種腫瘤中都已證實是存在的，它作為一種腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene，TSG），其啟動子的高甲基化參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本實驗通過研究5'-氮雜-2'-脫氧胞苷（5'-Aza-CdR）對HT-29和LoVo細胞株作用后Wif-1基因的DNA層面、mRNA層面和蛋白層面的改變，探討腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中Wif-1基因失活的甲基化機制及藥物恢復(fù)Wif-1基因表達的可能性，以期尋找CRC的腫瘤標志物及新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)直腸癌細胞株HT-29和LoVo（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部107實驗室）；DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司）；核酸蛋白質(zhì)濃度測量儀B-500（上海創(chuàng)萌生物科技有限公司），DNA甲基化修飾試劑盒及甲基化陽性/陰性對照（美國ZYMO公司）；qPCR反應(yīng)試劑ROX（TaKaRa公司）；Mix（上海輝睿生物科技有限公司）；Mx3000P定量PCR擴增儀（美國Stratagene公司）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；5'-Aza-CdR（美國Sigma公司），以DMSO溶劑充分溶解后配制成0.1 μmol/L的母液，分裝后-80℃保存；Wif-1和內(nèi)參β-actin（美國Santa Cruz公司），Western blot相關(guān)試劑（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)和干預(yù)

結(jié)直腸癌細胞株HT-29和LoVo置于10%胎牛血清和100 μ/mL青霉素、鏈霉素的RPMI1640的培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，胰酶消化傳代。取貼壁生長良好的細胞以RPMI1640調(diào)整細胞密度至2×106/mL，接種于六孔培養(yǎng)板。干預(yù)的LoVo和HT-29細胞分別加入0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR混合培養(yǎng)液，每24小時更換新鮮培養(yǎng)基，連續(xù)作用72 h；以HT-29和LoVo分別加入等量DMSO溶劑培養(yǎng)作為對照（0 μmol/L）。

1.3 Methylight方法

取對數(shù)生長期的HT-29和LoVo細胞株，胰酶消化后抽提DNA。抽提DNA按DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司）說明提取上述兩種細胞不同濃度梯度的細胞DNA，用紫外分光光度儀（上海創(chuàng)萌生物科技有限公司）測DNA濃度，以DNA濃度在25 ng/μL為最低濃度，使用DNA修飾試劑盒進行亞硫酸氫鹽修飾，按照試劑盒說明書操作，Wif-1基因甲基化引物和探針設(shè)計：Wif-1基因序列參照GenBank。甲基化引物和探針由Beacon Designer 7.9軟件設(shè)計，其引物序列上游引物：5'-TAAACGGGAATAGTTTTGGTTGAGG-3'；下游引物：5'- TACTACTCAAAACCTCCTCCTCGCTAC-3'；探針：FAM 5'- CTCCTCGTACCGCACCTACGCAACCTA-3' BHQ1，內(nèi)參β-actin基因甲基化按文獻[3]設(shè)計，上游引物：5'-TGGTCATC CAGGTTTAGTAACT-3'，下游引物：5'-AACCAATAAAC CTACTCCTCCCTTAA-3'，探針：FAM 5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3'BHQ1。PCR反應(yīng)總體系為20 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL；修飾后的DNA模板2 μL；上、下游引物各1 μL（10 pmol）；探針FAM 0.4 μL（10 pmol）；ROX 0.3 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，共50個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃冷卻5 min。經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的Human Methylated & Non-methylated DNA Set作為陽性、陰性對照，水為空白對照。

1.4 實時熒光定量PCR分析結(jié)直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因mRNA的表達情況

取對數(shù)生長期的HT-29和LoVo細胞，胰酶消化后抽提細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行實時熒光定量PCR。Wif-1引物由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，上游引物：5'- GTTCCACGGACCTCACT-3'，下游引物：5'-ATGTCGGAGTTCACCAGA-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物：5'-GGCTGCTTTTAACTCTGG-3'，下游引物：5'-GGAGGGATCTCGCTCC-3'。20 Μl PCR反應(yīng)體系含10 μL SYBR Premix Ex TaqTM（2×）、上、下游引物（10 μmol/L）各1、0.3 μL ROX Reference Dye（50×）、4.0 μL DNA模板、3.7 μL dH2O。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃ 10 s，55℃ 40 s，72℃ 45 s，共40個循環(huán)；72℃延伸1 min，70℃延伸30 s，95℃延伸30 s。實驗重復(fù)3次，取均值。擴增完畢后分析熔解曲線，采用2-ΔΔCt法分析Wif-1 mRNA表達。ΔΔCt=（Ct處理組目的基因-Ct處理組內(nèi)參基因）-（Ct對照組目的基因-Ct對照組內(nèi)參基因）。

1.5 Western blot分析結(jié)直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1蛋白的表達情況

取對數(shù)生長期的HT-29和LoVo細胞，在上述兩種細胞株各個濃度梯度的每管細胞中加入80 μL蛋白裂解和1 μL蛋白酶抑制劑PMSF液于冰上裂解30 min。15 000 r/min 37℃離心，10 min后取上清液提取總蛋白，BCA法蛋白定量?？偟鞍?00℃變性5 min后，配制濃度為12%的SDS-PAGE凝膠，進行蛋白質(zhì)電泳，蛋白電泳分離后經(jīng)電轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)移至PVDF膜。BSA室溫封閉2 h后，PVDF膜置于1∶200稀釋的Wif-1單克隆抗體稀釋液中4℃冰箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，再置于1∶20 000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG稀釋液中37℃培養(yǎng)2 h，TBST洗膜4次，每次10 min，然后加入ECL發(fā)光液顯影，采集并分析處理圖像。凝膠成像系統(tǒng)攝像并分析各條帶吸光度值，以0.5 μmol/L 5'-Aza-CdR條帶吸光度值（A）/β-actin條帶吸光度值（A）為基準，設(shè)置為1。以目的基因條帶吸光度值（A）/β-actin條帶吸光度值（A）作為Wif-1蛋白的相對表達強度。實驗重復(fù)3次，取其平均值。

1.6 MethyLight結(jié)果判斷標準

同時擴增目的基因（Wif-1）和內(nèi)參基因（β-actin），根據(jù)標準曲線得到兩者的原始拷貝數(shù)，計算標準甲基化指數(shù)（the normalized index of methylation，NIM）。其定義為：NIM=[（Wif-1 sample/Wif-1 positive）/（β-actin sample/β-actin positive）]×100，其中Wif-1 sample指樣本中甲基化Wif-1基因的拷貝數(shù)，Wif-1 positive指陽性對照中甲基化Wif-1基因的拷貝數(shù)，β-actin sample指樣本中甲基化Wif-1基因的拷貝數(shù)，β-actin positve指陽性對照中甲基化Wif-1基因的拷貝數(shù)。NIM≥4為甲基化，NIM<4為非甲基化[4]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），行配對t檢驗，并設(shè)定P值為雙側(cè)分布，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因甲基化狀況

將陽性對照按10的倍數(shù)稀釋成1×100～1×10-6 7個濃度梯度制作標準曲線（其拷貝數(shù)為103～109/mL）。各濃度梯度反應(yīng)均做復(fù)孔。MethyLight的線性范圍為104～108拷貝/mL，R2為0.907。實時熒光定量PCR得出數(shù)據(jù)按MethyLight結(jié)果判斷標準，在DMSO對照組、0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR中HT-29和LoVo細胞株中Wif-1基因甲基化狀態(tài)分別為甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化。見表1、圖1。

表1 HT-29和LoVo細胞株中Wif-1基因甲基化狀況

2.2 結(jié)直腸癌細胞株LoVo和HT-29中Wif-1基因mRNA表達狀況

實時熒光定量PCR得出的數(shù)據(jù)檢驗擴增效率（E）通過公式E=2-1/斜率-1計算，Wif-1基因mRNA為0.945，GAPDH基因mRNA為0.977，兩個基因的擴增效率相差<5%，符合用2-ΔΔCt法相對定量分析條件。經(jīng)2-ΔΔCt法分析并以對照組、各不同濃度實驗分組為橫坐標，將測出相應(yīng)的平均相對定量比值為縱坐標，繪出柱狀圖后發(fā)現(xiàn)0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細胞株中Wif-1基因的mRNA表達水平較DMSO對照組上調(diào)，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=144.823，P=0.000），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 6.945，P = 0.020；t = 41.629，P = 0.001；t = 14.262，P = 0.005）；LoVo細胞株中Wif-1 mRNA表達水平較DMSO對照組上調(diào)，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=476.195，P=0.000），與對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t = 10.656，P = 0.009；t = 25.486，P = 0.002；t = 51.323，P = 0.000）。見表2、圖2。

表2 HT-29和LoVo細胞株中Wif-1基因mRNA表達狀況（x±s）

注：與DMSO對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

2.3結(jié)直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1蛋白表達狀況

Western blot結(jié)果運用Image J軟件進行條帶圖像分析，獲得HT-29和LoVo細胞株各條帶光密度值，并計算出兩種細胞在各組中的平均光密度比值，進行半定量分析及統(tǒng)計學(xué)分析，并以各實驗分組為橫坐標，將測出相應(yīng)的平均光密度比值為縱坐標，繪出柱狀圖后發(fā)現(xiàn)0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細胞株中Wif-1蛋白表達水平較DMSO對照組上調(diào)，并且有藥物濃度依賴性（F=129.674，P=0.000），與DMSO對照組比較，1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo細胞株中Wif-1基因的蛋白表達水平較DMSO對照組略微上調(diào)，并且有藥物濃度依賴性但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.117，P=0.948），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t = 19.414，P = 0.003；t = 30.468，P = 0.001；t = 102.233，P = 0.000）。見表3、圖3。

表3 HT-29和LoVo細胞株中Wif-1蛋白表達狀況（x±s）

注：與DMSO對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

A：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中HT-29細胞株Wif-1蛋白Westernblot條帶圖；B：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中HT-29細胞株Wif-1蛋白柱狀圖；C：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中LoVo細胞株Wif-1蛋白Westernblot條帶圖；D：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中LoVo細胞株Wif-1蛋白柱狀圖

圖3 各組HT-29細胞株及LoVo細胞株Wif-1蛋白表達

3討論

CRC是最常見的消化道惡性腫瘤之一，每年全球新發(fā)病例達123萬，病死率約為發(fā)病率的1/2。我國CRC發(fā)病率雖低于西方發(fā)達國家，但近20年來CRC的發(fā)病率仍在逐漸上升，同時，其發(fā)病年齡有增高趨勢。近年研究表明CRC的發(fā)病是多因素、多階段、多基因連續(xù)累積發(fā)生的過程，除遺傳學(xué)改變外，表觀遺傳學(xué)改變亦參與CRC的發(fā)生、發(fā)展過程。表觀遺傳學(xué)是指不涉及DNA序列改變，但基因表達卻發(fā)生可遺傳的改變，DNA甲基化、組蛋白修飾、MicroRNA等是表觀遺傳學(xué)的主要形式。與腫瘤發(fā)生關(guān)系最密切的是DNA甲基化修飾異常，其中包括基因組去甲基化及部分區(qū)域高度甲基化兩種形式。DNA甲基化可以導(dǎo)致癌相關(guān)基因沉默，病變迅速進展為癌。CRC有若干高度甲基化基因，若能認識CRC中基因異常DNA甲基化，將可能獲得CRC診斷的腫瘤標志物及新的治療靶點[5-7]。

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路發(fā)現(xiàn)迄今已數(shù)十年，作為一條高度保守的信號通路在動物胚胎的器官發(fā)育各個階段均發(fā)揮異常重要的作用。Wif-1基因是Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路的拮抗基因之一，屬SFRP拮抗家族，在種族間高度保守，最早在人類視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)[8]。它主要通過捆綁Wnt信號蛋白，阻止其與Frizzled受體相互作用，從而抑制通路的異常激活。Nosho等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，在早期CRC中伴有Wif-1表達的下調(diào)，可能通過引起經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的激活，導(dǎo)致通路下游靶基因的過度表達，伴隨細胞過度的增殖和失控的分化從而引起腫瘤的發(fā)生。表觀遺傳學(xué)改變?nèi)缁?′端CpG島甲基化是Wif-1基因失活的重要機制。已有一系列研究證實在各系統(tǒng)腫瘤中，啟動子區(qū)甲基化可引起Wif-1基因失活[10-12]。在CRC中，Taniguchi等[13]和Lee等[14]的研究顯示，Wif-1啟動子區(qū)的甲基化率都很高，分別為82.0%和74%。齊健等[15]的研究結(jié)果與國外基本一致，Wif-1甲基化率為84.7%。Wif-1基因的啟動子中存在T細胞相關(guān)因子（T cell factor，TCF）的反應(yīng)元件[11]，而TCF是目前已知的Wnt通路中重要的核內(nèi)靶因子，Wnt信號活化可使β-catenin在胞漿內(nèi)累積并進入核內(nèi)識別淋巴結(jié)增強因子/T細胞相關(guān)因子（lymphoid enhancer factor/T cell factor，LEF/TCF）等轉(zhuǎn)錄因子，激活Wnt信號的靶基因，控制胚胎發(fā)育及細胞生長、分化及凋亡等。Kansara等[16]和Chung等[17]的研究結(jié)果顯示，Wnt拮抗物的高甲基化可以增加β-catenin在細胞質(zhì)中的積聚及經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的激活。

本實驗研究中筆者采用去甲基化藥物5'-Aza-CdR處理兩個結(jié)直腸癌細胞株：MSS細胞株HT-29和MSI細胞株LoVo后通過實時熒光定量PCR檢測，筆者發(fā)現(xiàn)DNA層面上DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-Aza-dCR中HT-29細胞株中Wif-1基因甲基化狀態(tài)分別為甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化，LoVo細胞株中Wif-1基因甲基化狀態(tài)都為未甲基化，說明去甲基化藥物5′-Aza-CdR能夠逆轉(zhuǎn)Wif-1基因甲基化狀態(tài)，同時在mRNA層面上筆者發(fā)現(xiàn)在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細胞株中Wif-1基因的mRNA表達水平較DMSO對照組上調(diào)，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=144.823，P=0.000），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.945，P=0.020；t=41.629，P=0.001；t=14.262，P=0.005）；LoVo細胞株中Wif-1基因的mRNA表達水平較DMSO對照組上調(diào)，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=476.195，P=0.000），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.656，P=0.009；t=25.486，P=0.002；t=51.323，P=0.000）。最后通過Western blot在蛋白層面上發(fā)現(xiàn)在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細胞株中Wif-1蛋白表達水平較DMSO對照組上調(diào)，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=129.674，P=0.000），與DMSO對照組比較，1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo細胞株中Wif-1基因的蛋白表達水平較DMSO對照組略微上調(diào)，并且有藥物濃度依賴性但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.117，P=0.948），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t=19.414，P=0.003；t=30.468，P=0.001；t=102.233，P=0.000）。

本實驗研究顯示甲基化酶抑制劑5′-aza-dC可通過啟動子甲基化而失活的Wif-1基因的異常甲基化狀態(tài)得到逆轉(zhuǎn)，而使該抑癌基因恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄活性，以使該基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮可能的抑制腫瘤的作用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多種途徑和多種基因的改變，其中表觀遺傳學(xué)的變化逐漸受到醫(yī)學(xué)研究的重視。異常甲基化是表觀遺傳學(xué)研究的一個重要內(nèi)容，往往是導(dǎo)致抑癌基因失活的主要原因。本研究希望能通過對異常甲基化的進一步研究，來尋求結(jié)直腸腫瘤診斷的新標志物和治療的新靶點。

[參考文獻]

[1] Siegel R，Ma J，Zou Z，et al. Cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin，2014，64（1）：9-29.

[2] Karim R，Tse G，Putti T，et al. The significance of the Wnt pathway in the pathology of human cancers [J]. Pathology，2004，36（2）：120-128.

[3] Ogino S，Kawasaki T，Brahmandam M，et al. Precision and performance characteristics of bisulfite conversion and real-time PCR（MethyLight） for quantitative DNA methylation analysis [J]. J Mol Diagn，2006，8（2）：209-217.

[4] Campbell DJ，Koch MA. Phenotypical and functional specialization of FOXP3+ regulatory T cells [J]. Nat Rev Immunol，2011，11（2）：119-130.

[5] Snover DC. Update on the serrated pathway to colorectal carcinoma [J]. Hum Pathol， 2011，42（1）：1-10.

[6] Dhir M，Yachida S，Van Neste L，et al. Sessile serrated adenomas and classical adenomas：an epigenetic perspective on premalignant neoplastic lesions of the gastrointestinal tract [J]. Int J Cancer，2011，129（8）：1889-1898.

[7] Arber N，Shapira I，Ratan J，et al. Activation of c-K-ras mutations in human gastrointestinal tumors [J]. Gastroenterology，2000，118（6）：1045-1050.

[8] Hsieh JC，Kodjabachian L，Rebbert ML，et al. A new secreted protein that binds to Wnt proteins and inhibits their activities [J]. Nature，1999，398（6726）：431-436.

[9] Nosho K，Yamamoto H，Takahashi T，et al. Genetic and epigenetic profiling in early colorectal tumors and prediction of invasive potential in pT1 （early invasive） colorectal cancers [J]. Carcinogenesis，2007，28（6）：1364-1370.

[10] Chan SL，Cui Y，van Hasselt A，et al. The tumor suppressor Wnt inhibitory factor 1 is frequently methylated in nasopharyngeal and esophageal carcinomas [J]. Lab Invest，2007，87（7）：644-650.

[11] Mazieres J，He B，You L，et al. Wnt inhibitory factor-1 is silenced by promoter hypermethylation in human lung cancer [J]. Cancer Res，2004，64（14）：4717-4720.

[12] Urakami S，Shiina H，Enokida H，et al. Epigenetic inactivation of Wnt inhibitory factor-1 plays an important role in bladder cancer through aberrant canonical Wnt/beta-catenin signaling pathway [J]. Clin Cancer Res，2006，12（2）：383-391.

[13] Taniguchi H，Yamamoto H，Hirata T，et al. Frequent epigenetic inactivation of Wnt inhibitory factor-1 in human gastrointestinal cancers [J]. Oncogene，2005，24（53）：7946-7952.

[14] Lee BB，Lee EJ，Jung EH，et al. Aberrant methylation of APC，MGMT，RASSF2A，and Wif-1 genes in plasma as a biomarker for early detection of colorectal cancer [J]. Clin Cancer Res，2009，15（19）：6185-6191.

[15] 齊健，朱尤慶，羅峻，等.分泌型Wnt拮抗基因甲基化在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2007， 87（28）：1954-1957.

[16] Kansara M，Tsang M，Kodjabachian L，et al. Wnt inhibitory factor 1 is epigenetically silenced in human osteosarcoma， and targeted disruption accelerates osteosarcomagenesis in mice [J]. J Clin Invest，2009，119（4）：837-851.

[17] Chung MT，Sytwu HK，Yan MD，et al. Promoter methylation of SFRPs gene family in cervical cancer [J]. Gynecol Oncol，2009，112（2）：301-306.

（收稿日期：2014-02-11 本文編輯：衛(wèi) 軻）