于春艷，劉 希，于春榮，張 鈺，蘇 靜，劉玉和，康勁松

（1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)化學(xué)與生物學(xué)院，吉林 吉林 132013；3.北京昭衍新藥研究中心有限公司毒理部，北京100176；4.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，吉林 長春 130021）

氧化應(yīng)激可能通過引起蛋白氧化及積聚誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[1－2]。當(dāng)錯誤折疊蛋白積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）被激活。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過增強(qiáng)蛋白折疊能力或促使錯誤折疊蛋白至細(xì)胞漿而被蛋白酶體降解，發(fā)揮促細(xì)胞生存作用。為了清除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)不能被蛋白酶體降解的錯誤折疊蛋白，UPR可能上調(diào)細(xì)胞自噬而發(fā)揮作用[3－4]。本文作者前期研究[5]發(fā)現(xiàn)：氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑維生素K3（VK3）能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生自噬。然而，VK3是否能激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR，以及UPR在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)自噬中的作用尚不清楚。因此，本實(shí)驗以Hela細(xì)胞為研究對象，利用VK3復(fù)制氧化應(yīng)激模型，應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑?；切苋パ跛徕c（tauroursodeoxycholic acid sodium，TUDC）觀察VK3是否激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白，及被激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白在VK3誘導(dǎo)Hela細(xì)胞自噬中的作用，初步探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激－自噬途徑在調(diào)控腫瘤細(xì)胞生存過程中的作用，為腫瘤的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1

.1 材 料 人Hela細(xì)胞購自中國科學(xué)院和北京協(xié)和醫(yī)院；新生小牛血清（Gibco公司，美國），IMDM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國），MTT粉末（Sigma公司，美國），細(xì)胞裂解液RIPA（碧云天生物技術(shù)有限公司）；TUDC、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特征性分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、自噬微管相關(guān)蛋白1輕鏈3抗 體（microtubule-associated protein 1light chain 3，LC3）及β-actin抗體（Santa Cruz公司，美國）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基（10% 新生牛血清，IMDM 培養(yǎng)液，pH7.4）中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實(shí)驗分為對照組（細(xì)胞用 IMDM 培 養(yǎng)）、VK3（30μmol·L－1）組、TUDC （500μmol·L－1） 組 和 VK3（30μmol·L－1）與TUDC（500μmol·L－1）聯(lián)合作用組。

1.3 透射電鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)學(xué)變化 各組細(xì)胞1 000r·min－1離心10min，取沉淀細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，乙醇系列脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，LKB2Ⅲ型超薄切片機(jī)半薄切片定位后做超薄切片，醋酸雙鈾及檸檬酸鉛雙重染色，JEM21200EX型透射電鏡觀察、對比觀察其超微結(jié)構(gòu)的變化，并攝片。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞生存率 各組細(xì)胞濃度為1×104/孔，以每孔100μL接種于96孔培養(yǎng)板，每組細(xì)胞5復(fù)孔。于培養(yǎng)結(jié)束前4h，加入5g·L－1MTT 20μL。培養(yǎng)結(jié)束后，傾去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150μL，微量振蕩器混勻，使結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀于570nm波長處測定其吸光度（A）值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量，用以計算細(xì)胞生存率。對照組細(xì)胞生存率為100%，其余各組細(xì)胞生存率＝（各細(xì)胞組A值/對照組A值）×100%。

1.5 Western blotting法檢測GRP78和膜型LC（LC3-Ⅱ）蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，以β-actin的水平作為等量蛋白質(zhì)上樣對照，取50μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；5%奶粉室溫封閉2h后，用含0.01%Tween20的TBS緩沖液（TBST）漂洗3次，每次10min；加入相應(yīng)的抗體（Santa公司）（1∶200），4℃孵育過夜，TBST漂洗3次后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000），37℃搖床溫育2h；TBST漂洗3次，每次10min；DAB顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司GIS凝膠成像系統(tǒng)）拍照，同時以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行蛋白表達(dá)分析，蛋白表達(dá)水平以A值比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 透射電鏡觀察對照組和VK3組Hela細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 透射電鏡觀察，對照組Hela細(xì)胞表現(xiàn)為正常細(xì)胞形態(tài)，微絨毛多，細(xì)胞核圓形。VK3組Hela細(xì)胞體積變大，微絨毛減少，核內(nèi)染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞漿內(nèi)有圓形的空泡生成，空泡內(nèi)可見內(nèi)容物，提示細(xì)胞內(nèi)形成了自噬泡；細(xì)胞漿內(nèi)還可見擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。見圖1。行統(tǒng)計學(xué)處理，細(xì)胞生存率及GRP78和LC3－Ⅱ蛋白表達(dá)水平以

圖1 透射電鏡觀察各組Hela細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure of endoplasmic reticulum of Hela cells in various groups observed by transmission electron microscope

2.2 MTT法檢測各組Hela細(xì)胞生存率 對照組細(xì)胞生存率為100%，TUDC組細(xì)胞生存率為98.9%±1.23%。與 VK3組（68.1% ±1.53%）比較，VK3與TUDC聯(lián)合作用組細(xì)胞存活率（30.8%±3.37%）明顯降低（P＜0.05）。

2.3 Western blotting法檢測Hela細(xì)胞GRP78和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平 與對照組（0.68±0.03）比較，VK3組GRP78的表達(dá)水平（0.79±0.05）增加（P＜0.05）；與 VK3 組比較，VK3 與TUDC聯(lián)合作用組GRP78的表達(dá)水平（0.59±0.03）降低（P＜0.05）；與對照組比較，TUDC組GRP78的表達(dá)水平（0.67±0.02）無明顯變化（P＞0.05），表明 TUDC減弱了 VK3誘導(dǎo)的UPR。見圖2。

與對照組（0.56±0.02）比較，VK3 組LC3-Ⅱ表達(dá)水平（0.72±0.04）增加（P＜0.05），TUDC組LC3－Ⅱ表達(dá)水平（0.55±0.01）無明顯變化（P＞0.05）；與 VK3 組比較，VK3 與TUDC聯(lián)合作用組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平（0.55±0.02）降低（P＜0.05）。見圖3。

圖2 Western blotting法檢測各組Hele細(xì)胞GRP78表達(dá)Fig.2 Expressions of GRP78in Hela cells in various groups detected by Western blotting method

圖3 Western blotting法檢測各組Hela細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)Fig.3 Expressions of LC3-Ⅱ protein in Hela cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

在真核細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、修飾及運(yùn)輸過程。抗腫瘤藥物、氧化應(yīng)激能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡的紊亂，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上待折疊修飾蛋白過載，造成未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中累積被稱為UPR，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78/BIP（glucose-regulated protein 78 / binding immunoglobulin protein）等及其下游的信號傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白[7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會引起從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的信號傳導(dǎo)，通過暫時抑制蛋白質(zhì)翻譯、增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)具有折疊能力的基因轉(zhuǎn)錄而減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白負(fù)擔(dān)，最終幫助細(xì)胞恢復(fù)穩(wěn)態(tài)并得以存活。如果這個轉(zhuǎn)錄程序不能重新恢復(fù)適當(dāng)?shù)膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，那么持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[8]。有研究[9]發(fā)現(xiàn)：RNA 干擾 GRP78蛋白表達(dá)，使順鉑和阿霉素誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞的凋亡增多。本研究電鏡結(jié)果顯示：VK3組細(xì)胞可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，GRP78表達(dá)增加；與VK3組比較，VK3與TUDC聯(lián)合應(yīng)用組Hela細(xì)胞生存率降低。本研究結(jié)果提示：在VK3誘導(dǎo)氧化應(yīng)激時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，被激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白可能減輕氧化應(yīng)激導(dǎo)致的損傷。

細(xì)胞自噬是指細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物被雙層膜形成的自噬泡包裹，并運(yùn)送到溶酶體形成自噬溶酶體并降解其內(nèi)容物的過程[10]。LC3蛋白具有2種細(xì)胞形式，即LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ。LC3-Ⅰ在自噬體形成過程中通過接合PE轉(zhuǎn)變成LC3－Ⅱ，因此LC3－Ⅱ的數(shù)量是自噬體形成的早期標(biāo)志物。有研究[11]發(fā)現(xiàn)：順鉑作用Hela細(xì)胞激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，介導(dǎo)了細(xì)胞自噬的發(fā)生。自噬可清除受損或多余的蛋白質(zhì)及細(xì)胞器，對于細(xì)胞保持穩(wěn)態(tài)具有重要意義，尤其在細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激時的生存機(jī)制中起決定性作用[12－13]。本研究結(jié)果顯示：TUDC 聯(lián)合 VK3作用，降低了VK3誘導(dǎo)的自噬相關(guān)蛋白LC3－Ⅱ的表達(dá)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白GRP78的表達(dá)，表明VK3誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白，介導(dǎo)了細(xì)胞自噬的發(fā)生，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬在功能上有聯(lián)系。本課題組的前期研究[14]結(jié)果顯示：VK3激活的自噬能清除泛素化蛋白，減少線粒體途徑細(xì)胞凋亡。結(jié)合以上結(jié)果，本文作者認(rèn)為：VK3誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白介導(dǎo)發(fā)生的細(xì)胞自噬，可能通過清除細(xì)胞內(nèi)被氧化應(yīng)激損傷的蛋白及細(xì)胞器，具有減輕氧化應(yīng)激損傷作用。

有研究[13，15－16]發(fā)現(xiàn)：自噬體的膜可以從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜衍生出來。在清除錯誤折疊蛋白方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和自噬體膜之間似乎存在著直接動態(tài)的相互作用。目前，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)自噬發(fā)生的信號途徑還有待于進(jìn)一步研究。

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