国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

地塞米松聯(lián)合淀粉樣β蛋白對大鼠海馬組織損傷的實驗研究

2014-09-19 10:21:40袁曉玲王景方任鴻雁董子峰孔輝
中國生化藥物雜志 2014年6期
關鍵詞:彗星海馬游泳

袁曉玲,王景方,任鴻雁,董子峰△,孔輝

(1.聊城市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,山東 聊城 252000;2.聊城市東昌府區(qū)人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,山東 聊城 252000;3.南京醫(yī)科大學,江蘇 南京 210029)

地塞米松聯(lián)合淀粉樣β蛋白對大鼠海馬組織損傷的實驗研究

袁曉玲1,王景方2,任鴻雁1,董子峰1△,孔輝3

(1.聊城市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,山東 聊城 252000;2.聊城市東昌府區(qū)人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,山東 聊城 252000;3.南京醫(yī)科大學,江蘇 南京 210029)

目的 探討地塞米松(dexamethasone,DEX)聯(lián)合淀粉樣β蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)對大鼠海馬組織的損傷機制。方法 采用水迷宮方法檢測DEX聯(lián)合淀粉樣β蛋白對大鼠學習記憶的影響;采用MTT方法檢測DEX聯(lián)合Aβ蛋白對大鼠海馬神經(jīng)元活力的影響作用;采用彗星實驗檢測DEX聯(lián)合Aβ蛋白對大鼠海馬神經(jīng)元中DNA的損傷程度。結(jié)果 與GC維持+DEX1組比較,GC維持+DEX1+Aβ組第10天的逃避潛伏期和游泳距離均延長,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與GC維持+DEX5組比較,GC維持+DEX5+Aβ組第10天的逃避潛伏期顯著延長,具有顯著性差異(P<0.01),第9、10天的游泳距離延長,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與GC維持+Aβ組比較,GC維持+DEX1+Aβ組第10天的逃避潛伏期和游泳距離均延長,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與GC維持+Aβ組比較,GC維持+DEX5+Aβ組第10天的逃避潛伏期顯著延長,具有顯著性差異(P<0.01),并且第10天游泳距離延長,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與溶劑對照組比較,各濃度的DEX分別與不同濃度的Aβ合用時,均會使海馬神經(jīng)元的活力下降,且差異均具統(tǒng)計學意義(P<0.05);DEX10+Aβ5組分別與DEX10組和Aβ5組比較,均有較嚴重彗星拖尾現(xiàn)象,且均具有顯著性差異(P<0.01)。結(jié)論 DEX與Aβ合用比單用DEX或Aβ對大鼠學習記憶力下降影響較大;DEX與Aβ合用從細胞水平上會降低海馬神經(jīng)元的活力,單用任何一種均無影響;DEX與Aβ合用會造成海馬神經(jīng)元中DNA損傷.

DEX;淀粉樣β蛋白;聯(lián)合作用;大鼠;海馬組織

阿爾茨海默病(alzheimer disease,AD)是一種起病隱匿、進行性發(fā)展、發(fā)病率高、危害極大的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。Spagnol G等[1]研究表明細胞凋亡可以降低阿爾茨海默病病人腦組織中神經(jīng)元的數(shù)量。有研究[2-3]表明AD的發(fā)病機制可能與神經(jīng)元被淀粉樣β蛋白誘導凋亡有關聯(lián)。AD主要的病理學特征是在細胞內(nèi)有神經(jīng)元纖維纏結(jié)出現(xiàn)并且在神經(jīng)元外有老年斑的沉積,老年斑的主要成分是淀粉樣β蛋白(amyloid beta protein,Aβ)。Aβ主要通過干擾鈣平衡和增強炎癥反應等引起神經(jīng)元異常,在AD的發(fā)病和發(fā)展中起重要作用[4]。20世紀90年代初有人發(fā)現(xiàn)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(hypothalamic-pituitary-adrenocortical,HPA)軸功能失調(diào)與AD有關。然而,海馬神經(jīng)元中含有大量機體正常分泌的糖皮質(zhì)激素(glueocortieoids,GC)受體。GC不僅可以穿過血腦屏障發(fā)揮生理和藥理作用,而且可以促進氧自由基神經(jīng)元的毒性。AD患者主要表現(xiàn)為循環(huán)中的基礎糖皮質(zhì)激素水平顯著升高及HPA軸的功能失調(diào)[5],目前出現(xiàn)這一現(xiàn)象的根本作用機制國內(nèi)外少有報道,因此,本研究通過動物實驗與分子水平實驗探討AD發(fā)病機制,觀察DEX和Aβ聯(lián)合作用對大鼠學習記憶能力的影響及可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:選取清潔級SD大鼠68只,動物許可證號:SCXK(蒙)2002-0001,購自蒙古大學動物中心,體質(zhì)量200~250 g,給予正常飼料喂養(yǎng),雌雄皆可(其中8只為已懷孕18d,用于體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元)。

1.1.2 主要試劑及儀器

Aβ蛋白:Sigma公司;DEX:Sigma公司;低糖DMEM培養(yǎng)基:Invitrogen Life Technologies公司;神經(jīng)元基礎培養(yǎng)液(neurobasal medium,NB):Gibco公司;Morris水迷宮儀:中國醫(yī)學科學院藥物研究所;超凈工作臺:江蘇蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;恒溫CO2培養(yǎng)箱:美國Thermo公司(250B型)

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗:分組給藥:將60只大鼠隨機分為6組,具體分組、用藥見表1。

表1 大鼠分組情況列表Tab.1 List of the rats grouping

各組大鼠均給予注射0.2 mg/kg的DEX以維持體內(nèi)基礎GC水平[6],需要給予Aβ的組別中的大鼠,注射Aβ前1天開始給予DEX,連續(xù)注射7 d,GC維持對照組給予等量0.4%乙醇溶媒。等量生理鹽水作為DEX的溶媒。DEX+Aβ組中的大鼠于CAl區(qū)注射給予4μL的Aβ。注射Aβ后的第5天對大鼠進行水迷宮訓練,訓練7 d,進行水迷宮實驗。

1.2.2 Morris水迷宮實驗:Morris水迷宮實驗的訓練和記錄方法參見文獻[7],水迷宮直徑為150 cm,水深50cm。每天從不同的象限入水訓練2次。第7天開始采用Morrismicrosoft基礎類應用程序紀錄逃避潛伏期(escape latency)和游泳距離(swiming distance),從以上2個方面來評價大鼠的學習記憶改變[8]。

1.2.3 生化與分子實驗

① 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng):參照Santos SF等[9]的方法進行體外海馬神經(jīng)元的培養(yǎng):將孕18d的大鼠斷頭處死,取胚胎海馬組織,剪成小塊,37℃胰蛋白酶消化20min,用含10%胎牛血清的NB洗3次,篩網(wǎng)過濾,計數(shù),置于96孔培養(yǎng)板(每孔5×104個),37℃,5%CO2環(huán)境下培養(yǎng),2~3 d換一次培養(yǎng)液,培養(yǎng)9 d后的海馬神經(jīng)元用于測定細胞活力和彗星實驗檢測DNA損傷。

②MTT比色法測定細胞活力:將實驗分為:單用DEX1組(1 μmol/L),單用 DEX10組(10μmol/L),單用 Aβl(1μmol/L),單用Aβ5(5μmol/L),DEX+Aβ組(1μmol/L DEX+1μmol/LAβ、1 μmol/L DEX+5μmol/LAβ、10 μmol/L DEX+1 μmol/LAβ、10 μmol/L DEX+5μmol/LAβ)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元到第9天,更換DMEM培養(yǎng)液(不加胎牛血清),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,加入含0.04%乙醇的無血清DMEM培養(yǎng)液或DEX,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后加入無血清DMEM培養(yǎng)液或Aβ,24 h后參照Jun DJ等[10]的方法測細胞存活率。細胞存活率(%)=(A實驗組/A對照組)×100%。

③彗星實驗檢測海馬神經(jīng)元DNA損傷:實驗分為:正常對照組(正常培養(yǎng)),單用DEX10組(10μmol/L)組,單用Aβ5組(5 μmol/L),和DEX10+Aβ5組(10 μmol/LDEX+5μmol/L Aβ)。按照相應的濃度不同時間段加入到培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h后,采用彗星實驗(單細胞凝膠電泳)檢測海馬神經(jīng)元中DNA的損傷,彗星實驗具體步驟參考Wang S等[11]研究。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)結(jié)果均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理,正態(tài)計量資料采用t檢驗或方差分析,計數(shù)資料比較采用χ2檢驗及Fisher精確概率法;規(guī)定P<0.05為有統(tǒng)計學差異,P<0.01有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 DEX與Aβ合用對大鼠學習記憶的影響 與GC維持對照組比較,GC維持+DEX1組及GC維持+DEX5組中大鼠的逃避潛伏期,游泳距離均有所縮小,但不具有顯著性差異;與GC維持對照組比較,GC維持+Aβ組中大鼠的逃避潛伏期和游泳距離均有延長趨勢,但無統(tǒng)計學意義;與GC維持+DEX1組比較,GC維持+DEX1+Aβ組第10天的逃避潛伏期和游泳距離均延長,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與GC維持+DEX5組比較,GC維持+DEX5+Aβ組第10天的逃避潛伏期顯著延長,具有顯著性差異(P<0.01),第9、10天的游泳距離延長,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與GC維持+Aβ組比較,GC維持+DEX1+Aβ組第10天的逃避潛伏期和游泳距離均延長,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與GC維持+Aβ組比較,GC維持+DEX5+Aβ組第10天的逃避潛伏期顯著延長,具有顯著性差異(P<0.01),并且第10天游泳距離也延長,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表2)。

表2 DEX與Aβ合用對大鼠學習記憶的影響Tab.2 Effect of DEX combined with Aβon learning and memory in rats

2.2 DEX與Aβ合用對海馬神經(jīng)元活力的影響 與溶劑對照組比較,單用DEX和單用Aβ在各濃度值對海馬神經(jīng)元的活力都無影響;與溶劑對照組比較,各濃度的DEX分別與不同濃度的Aβ合用時,都會使海馬神經(jīng)元的活力下降,差異均具統(tǒng)計學意義(P<0.05);與相同濃度Aβ組比較,各濃度的DEX分別與不同濃度的Aβ合用時,都會使海馬神經(jīng)元的活力下降,差異均具統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表3)。

表3 DEX與Aβ合用對海馬神經(jīng)元活力的影響Tab.3 The impact of DEX combined with Aβon the vitality of hippocampal neurons

2.3 DEX與Aβ合用對海馬神經(jīng)元彗星拖尾長度的影響

表4顯示DEX10組對海馬神經(jīng)元有輕度彗星拖尾現(xiàn)象,但與溶劑對照組比較差異無統(tǒng)計學意義;Aβ5組對海馬神經(jīng)元有輕度彗星拖尾現(xiàn)象,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與溶劑對照組比較,DEX10+Aβ5組有嚴重彗星拖尾現(xiàn)象,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與Aβ5組比較,DEX10+Aβ5組有嚴重彗星拖尾現(xiàn)象,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見表4),表明DEX10可進一步促進Aβ延長海馬神經(jīng)元彗星拖尾長度,增加海馬神經(jīng)元的損傷。

表4 DEX與Aβ合用對海馬神經(jīng)元DNA損傷的影響(μm)Tab.4 The impact of DEX combined with Aβon DNA damage in hippocampal neurons(μm)

3 討論

DEX和Aβ的聯(lián)合損傷作用具有協(xié)同或相加作用可能會促進AD的發(fā)生和發(fā)展。Cheng A等[12]的研究證實,神經(jīng)元細胞中DNA損傷能夠?qū)е律窠?jīng)元凋亡,能夠誘導 AD發(fā)病。Ge YS等[13]的研究表明,較多的糖皮質(zhì)激素和Aβ對神經(jīng)元均有毒性。Kleen JK及其他學者[14-16]的研究表明,糖皮質(zhì)激素含量的增高會破壞海馬神經(jīng)元樹突的完整性,甚至可以導致海馬神經(jīng)元的死亡。然而本研究結(jié)合動物水平與分子水平對DEX與Aβ聯(lián)合作用對大鼠海馬組織損傷作用進行研究,從微觀到宏觀揭示DEX與Aβ聯(lián)合引起大鼠海馬組織損傷的作用機制。

本研究中,大鼠水迷宮實驗顯示:與GC維持+DEX相應濃度組比較,GC維持+DEX1+Aβ組第10天的逃避潛伏期和游泳距離均有延長;與GC維持+Aβ組比較,GC維持+DEX1、5+Aβ組第10天的逃避潛伏期和游泳距離均有延長;這說明DEX與Aβ合用比單用DEX或Aβ對大鼠學習記憶力下降影響大,這是由于DEX和Aβ聯(lián)合作用致大鼠海馬神經(jīng)元損傷程度要比單用DEX或Aβ的程度大;MTT實驗結(jié)果為:單用DEX和單用Aβ無論哪個濃度值對海馬神經(jīng)元的活力均無影響,而當各濃度的DEX分別與不同濃度的Aβ合用時,均會使海馬神經(jīng)元的活力下降,這說明DEX與Aβ合用從細胞水平上會降低海馬神經(jīng)元的活力,單用DEX或Aβ任何一種均對海馬神經(jīng)元的活力無影響,這可能與DEX會增強Aβ干擾鈣平衡和增強炎癥反應有關,從而引起神經(jīng)元異常;彗星實驗結(jié)果為:DEX10+Aβ5組分別與DEX10組和Aβ5組比較,都有較嚴重彗星拖尾現(xiàn)象,這從DNA水平說明DEX10+Aβ5合用會造成海馬神經(jīng)元損傷,其原因為DEX與Aβ合用會損傷海馬神經(jīng)元中DNA。

總之,DEX與Aβ合用會降低大鼠海馬神經(jīng)元的活力,并且能夠損傷海馬神經(jīng)元中的DNA,從而降低大鼠學習記憶能力。此研究對AD的發(fā)病機制及預防有一定的實用價值。

[1] Spagnol G, Sorgen PL, Spray DC.Structural order in Pannexin 1 cytoplasmic domains.[J].Nature, Channels(Austin).2014, 8(2):133-135.

[2] KawasumiM,Hashimoto Y,Chiba T,et al.Molecularmechanisms for neuronal cell death by Alzheimer's amyloid precursor protein-relevant insults[M].Neurosignals,2012, 3(6):236-250.

[3] Granic A, Potter H.Mitotic spindle defects and chromosome missegregation induced by LDL/cholesterol-implications for Niemann-Pick C1, Alzheimer's disease, and atherosclerosis.[J].PLoSOne,2013, 8(4):97-104.

[4] Rothman SM,Herdener N,F(xiàn)rankola KA,et al.Chronic mild sleep restriction accentuates contextual memory impairments,and accumulations of cortical Aβand pTau in amousemodelof Alzheimer's disease[J].Brain Res,2013, 15(29):200-208.

[5] Csemansky JG, Dong H, Fagan AM, et al.Plasma cortisol and progression of dementia in subjects with Alzheimertype dementia[J].Am JPsychiatry, 2012, 163(12):2164-2169.

[6] SubburajuS, Aguililem G.Vasopressin mediatesmitogenie responses to adrenalectomy in the rat anterior pitmmy[J].Endocrinology,2010,148(7):3102-3110.

[7] Viana RJ1, Steer CJ, Rodrigues CM.Amyloid-β peptide-induced secretion of endoplasmic reticulum chaperone glycoprotein GRP94[J].JAlzheimers Dis.2011, 27(1):61-73.

[8] Hori M, Yamada K, Ohnishi J,et al.Tickling during adolescence alters fear-related and cognitive behaviors in rats after prolonged isolation.[J].Physiol Behav,2014, 11(14):47-60.

[9] Santos SF, PierrotN, MorelN, et al.Expression of human amyloid precursorprorein in rat cortical neurons inhibis calcium oscillatiorm[J].JNeurosci, 2009, 29(15):4708-4718.

[10] Jun DJ, Kim J, Jullg SY,et al.Exuaeelhlar ATPmediates necrotic cell swelling in SN4741 dopaminergie neurons through P2X7 receptom[J].JBiol Chem, 2009, 2s2(52):37350-37358.

[11] Wang S, Xing Z, Voder PS,et al.Cellular NAD replenishmem confers marked neumpmteetion against ischemie cell death:role of enlunced DNA repair[J].Stroke, 2012, 39(9):2587-2595.

[12] Cheng A,Shin-ya K,Wan R,et al.Telomere protection mechanism change during neurogenesis and neuronalmaturation:newly generated neurons are hypersensitive to telomere and DNA Dsmage[J].J Neurosci, 2010, 7(14):3722-3733.

[13] Ge YS,Teng WY,Zhang CD.Protectiveeffect of cyclophilin A against Alzheimer's amyioid beta-peptide(25-35).induced oxidative stress in PCI2 cells[J].ChinMed J(Ensl), 2009,122(6):716-724.

[14] Kleen JK, Sitomerbi T, Killeen PR, et al.Chronic stress impairs spatialmemory andmotivation for reward without disruptingmotor ability and motivation texplore[J].BehavNeurosci, 2009, 120 (4):842-851.

[15] Conrad CD,McLaughlinKJ, Harman JS, et al.Chronic glucocorticoid increase hippocampalvulnerability to neurotoxicity under conditiom that produce CA3 dendritic retraction but fail to impairspatial recognition memory[J].JNeurosci, 2010, 27(31):8278-8285.

[16] Santana PP, Carvalho CM, da Costa NN, et al.Effect of dexamethasone on development of in vitro-produced bovine embryos[J].Theriogenology.2014, 194(2):376-383.

(編校:譚玲)

Experimental study of am yloidβprotein combined w ith dexamethasone on hippocam pal tissue damage

YUAN Xiao-ling1,WANG Jing-fang2,REN Hong-yan1,DONG Zi-feng1Δ,KONG Hui3

(1.Department of Neurology,Liaocheng People's Hospital,Liaocheng 252000,China;2.Dongchangfu People's Hospital of Liaocheng City,Liaocheng 252000,China;3.Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)

Objective To explore the damage mechanisms of amyloid β protein combined with dexamethasone(DEX)on hippocampal tissue.Methods Morriswatermaze was used to detect effects of DEX combined with amyloid beta protein on learning and memory in rats.MTTmethod was used to detect influence of DEX combined with Aβprotein on vitality of rat hippocampal neurons.Comet assay was used to detect the damage extent of DEX combined with Aβprotein to rat hippocampal neurons DNA.Results Compared with the GC maintain+DEX1 group,the escape latency and swimming distance of rat in GCmaintain+DEX1+Aβgroups were prolonged on the tenth day,the difference was statistically significant(P<0.05).Compared with GCmaintain+DEX5 group,the escape latency of GCmaintain+DEX5+Aβgroup was significantly prolonged on the 10th day,there was significant difference(P<0.01),the swimming distance extension on the 9th and 10th day,the difference was statistically significant(P<0.05).Compared with GCmaintain+Aβgroup,escape latency and swimming distance of GCmaintain+DEX1+Aβgroups were prolonged,the difference was statistically significant(P<0.05).Compared with GCmaintain+Aβgroup,the escape latency ofGCmaintain+DEX5+Aβgroup was significantly prolonged on the 10th day,there was significant difference(P<0.01),the swimming distance extension on the 10th day.Compared with the control group,each concentration of DEX combined with different concentrations of Aβdecreased activity of hippocampal neurons,the differencewas statistically significant(P<0.05).Compared with the DEX10 group and Aβ5 group respectively,DEX10+Aβ5 group had amore severe comets smearing,there was significant difference(P<0.01).Conclusion DEX+Aβgroup has greater impact on learning and memory decline than single Aβgroup or single DEX group.On the cellular level,DEX+Aβgroup will reduce the viability of hippocampal neurons,any ofwhich alone had no effect;the combination of DEX and Aβcan cause DNA damage in hippocampal neurons.

DEX;amyloidβ-protein;combination;rat;hippocampus tissue

袁曉玲,女,碩士,主治醫(yī)師,研究方向:腦血管病方面,E-mail:13963528322@163.com;董子峰,通信作者,男,主治醫(yī)師,碩士,研究方向:神經(jīng)內(nèi)科臨床,E-mail:2532644214@qq.com。

R749

A

1005-1678(2014)06-0071-04

猜你喜歡
彗星海馬游泳
展覽“彗星來的那一夜”現(xiàn)場圖
西湖(2022年10期)2022-10-19 03:52:28
出發(fā)!炸掉那顆彗星
海馬
彗星
海馬
第十三章彗星撞地球
小學科學(2019年7期)2019-08-27 04:05:47
聽說你要去游泳 “妝”一下吧!
Coco薇(2017年8期)2017-08-03 16:11:23
胖胖一家和瘦瘦一家
“海馬”自述
游泳時小腿抽筋了
潞西市| 张家界市| 西乌珠穆沁旗| 安塞县| 铜梁县| 肥乡县| 嘉禾县| 伊春市| 台江县| 绥化市| 新安县| 元阳县| 石狮市| 双流县| 柳林县| 永州市| 刚察县| 广宗县| 天气| 江源县| 江津市| 武胜县| 岳池县| 商城县| 福州市| 凉城县| 保德县| 措勤县| 华宁县| 大足县| 四子王旗| 密云县| 上饶县| 尖扎县| 鹤岗市| 普格县| 福清市| 仁化县| 冷水江市| 开远市| 武胜县|