王秀閣，趙金祥，樸春麗，陳 曦，高林花

(長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春 130021)

解毒通絡保腎膠囊對糖尿病腎病大鼠腎組織中ColⅣ及FN表達的影響

王秀閣，趙金祥，樸春麗，陳 曦，高林花

(長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春 130021)

目的 探討解毒通絡保腎膠囊對糖尿病腎病(DN)大鼠腎組織中Ⅳ型膠原(ColⅣ)及纖維連接蛋白(FN)表達的影響。方法 高脂飼料喂飼加腹腔注射鏈脲佐菌素復制DN大鼠模型，隨機分為正常對照組、模型組、解毒通絡保腎組、陽性對照組(羅格列酮聯(lián)合貝那普利)。16周后采用免疫組化技術檢測各組大鼠腎小球中ColⅣ及FN的表達水平，同時檢測血糖、尿素氮、肌酐、尿微量白蛋白等指標的變化情況。結果 模型組大鼠血糖、尿素氮、肌酐、尿微量白蛋白、ColⅣ及FN的表達明顯升高(P＜0.01)，與模型組相比，解毒通絡保腎組大鼠血糖、尿素氮、肌酐、尿微量白蛋白、ColⅣ及FN的表達均明顯降低(P＜0.01)。結論 解毒通絡保腎膠囊能夠減少腎組織中ColⅣ、FN含量，抑制腎小球ECM積聚，延緩DN的進展。

解毒通絡保腎膠囊;糖尿病腎病;Ⅳ型膠原(ColⅣ);纖維連接蛋白

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病慢性并發(fā)癥，屬于糖尿病微血管病變，是糖尿病患者死亡的重要原因之一。中醫(yī)藥治療DN取得了較好的臨床療效，并具有其獨特優(yōu)勢，在改善臨床癥狀、降低各項生化指標、保護腎臟以及控制病情發(fā)展方面均起到重要作用，尤其在降尿蛋白方面，療效顯著［1］。本研究通過免疫組化實驗，對實驗性DN大鼠腎臟組織中ColⅣ和FN蛋白的沉積情況進行觀察，并以解毒通絡保腎膠囊進行干預，以探討解毒通絡保腎膠囊治療DN的療效及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型的復制 Wistar大鼠，雄性，110只，按體質量隨機分正常組10只，造模組100只。造模組大鼠給予高脂飼料，正常組大鼠給予普通飼料，連續(xù)喂養(yǎng)4周。4周后造模組大鼠一次性腹腔注射鏈尿佐菌素30 mg/kg，正常組大鼠腹腔注射等體積緩沖液。72 h后，造模組大鼠檢測空腹血糖(尾靜脈采血)及尿糖(尿糖試紙測)，以空腹血糖≥16.7 mmol/L，尿糖+++以上為標準，達到該標準的大鼠列為觀察對象。

1.2 實驗動物分組及給藥方法 造模成功的大鼠根據(jù)體質量及空腹血糖情況，隨機分為模型組、解毒通絡組、保腎組、解毒通絡保腎組、羅格列酮合用貝那普利組(陽性對照組)，每組15只。解毒通絡保腎組按1.4 g/kg體質量給予解毒通絡保腎膠囊混懸液灌胃(1.5 mL/100 g體質量)，解毒通絡組按1.4 g/kg體質量給予解毒通絡膠囊混懸液灌胃(1.5 mL/100 g體質量)，保腎組按1.4 g/kg體質量給予保腎膠囊混懸液灌胃(1.5 mL/100 g體質量)，陽性對照組按0.8 mg/kg體質量給予羅格列酮及2 mg/kg體質量給予貝那普利混懸液灌胃，正常對照組及模型組給予等體積蒸餾水灌胃，每日上午9時灌胃，連續(xù)灌胃12周。

1.3 主要試劑及藥品 鏈脲佐菌素:美國Sigma公司;兔抗大鼠ColⅣ多克隆抗體、兔抗大鼠FN多克隆抗體:北京博奧森生物技術有限公司;解毒通絡保腎膠囊:吉林省七星山藥業(yè)有限公司(J中藥字2009-1234號);解毒通絡膠囊、保腎膠囊均由吉林省七星山藥業(yè)有限公司協(xié)助制作;馬來酸羅格列酮片:天津葛蘭素史克公司(批號:H20020475);鹽酸貝那普利片:北京諾華制藥有限公司(批號:H20030514)。

1.4 標本采集及指標檢測 實驗期間，每2周檢測1次空腹尾靜脈血糖，每2周收集1次尿液測定尿微量白蛋白。實驗16周末，眶后靜脈取血備測生化指標。打開腹腔，切取一小塊腎皮質，固定于10%中性福爾馬林液中，免疫組化法檢測ColⅣ及FN。

1.4.1 生化指標檢測 Accu-chek Advantage血糖儀檢測血糖;日立7150型生化自動分析儀檢測血清尿素氮、血清肌酐含量。

1.4.2 尿微量白蛋白檢測 采用ELISA法檢測，按照試劑盒說明書操作。

1.4.3 免疫組化檢測 測定ColⅣ及FN。

1.5 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血糖、腎功能等指標變化比較 見表1。

表1 各組大鼠16周末空腹血糖、BUN、Scr含量變化比較(±s，n=15)

表1 各組大鼠16周末空腹血糖、BUN、Scr含量變化比較(±s，n=15)

注:與正常對照組比較，##P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.01;與解毒通絡保腎組比較，▲P＜0.05

組 別 空腹血糖/(mmol/L)BUN/(mmol/L)Scr/(μmol/L)正常對照組 4.78 ±0.49 7.34±0.79 72.90±5.21模型組 23.89 ±2.31## 21.29±1.01## 111.11±9.91##保腎組 9.52±1.35##△△ 15.68±0.95##△△▲ 97.87±3.26##△△▲解毒通絡組 9.12±1.13##△△ 15.35±1.23##△△▲ 96.43±5.37##△△▲解毒通絡保腎組 8.84±1.05##△△ 11.17±0.97##△△ 90.27±4.84##△△陽性對照組 9.51±1.30##△△ 12.52±0.97##△△▲ 93.80±6.89##△△▲

2.2 各組大鼠尿微量白蛋白動態(tài)變化比較 見表2。

表2 各組大鼠8，12，16周末尿微量白蛋白變化比較(±s，n=15)μg/mL

表2 各組大鼠8，12，16周末尿微量白蛋白變化比較(±s，n=15)μg/mL

注:與正常對照組比較，##P＜0.01;與模型組比較，△△P＜0.01

組 別 8周 12周 16周正常對照組 7.71 ±0.40 9.56±0.58 11.39±0.65模型組 13.40 ±1.65## 18.11±2.43## 21.36±3.14##保腎組 10.37±1.27##△△ 12.95±1.37##△△ 16.01±1.64##△△解毒通絡組 10.53±1.31##△△ 12.87±1.28##△△ 15.78±1.59##△△解毒通絡保腎組 10.22±1.29##△△ 12.64±1.42##△△ 15.20±1.76##△△陽性對照組 9.87±1.27##△△ 12.26±1.15##△△ 14.74±1.71##△△

2.3 各組大鼠腎組織ColⅣ、FN免疫組織化學檢測結果 見表3。

表3 各組大鼠16周末腎組織ColⅣ、FN蛋白表達半定量結果(±s，n=15)

表3 各組大鼠16周末腎組織ColⅣ、FN蛋白表達半定量結果(±s，n=15)

注:與正常對照組比較，##P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05;與解毒通絡保腎組比較，▲▲P＜0.01

組 別 ColⅣFN正常對照組 6.10 ±1.20 5.50 ±1.08模型組 24.44 ±1.42## 31.33 ±1.73##保腎組 16.48 ±1.43##△ 16.57±1.41##△▲▲解毒通絡組 15.75±1.32##△ 14.87±1.26##△▲▲解毒通絡保腎組 15.18±0.98##△ 7.63±0.67##△陽性對照組 15.90±1.59##△ 15.50±1.27##△▲▲

3 小結

解毒通絡保腎膠囊由榛花、大黃、黃芪、生地黃、黃連、枸杞子、丹參、地龍、金銀花等藥物組成，方中榛花、大黃共為君藥，重在解毒化瘀;黃連、金銀花清熱解毒、燥濕祛濁，黃芪、丹參益氣通絡、扶正抗毒，4藥共為臣藥，可起到助君藥增強解毒的作用;生地黃、枸杞子養(yǎng)陰生津、滋補肝腎，共為佐藥;地龍作為使藥，可走竄入絡。諸藥合用，共奏解毒通絡、保腎化瘀之功效。全方調和臟腑陰陽、平衡氣血、攻補兼施、扶正祛邪、使瘀濁祛，腎絡通，元氣旺，毒解腎安。

本研究結果表明，模型組大鼠腎小球內ColⅣ、FN的表達明顯升高，提示ColⅣ、FN能夠促進ECM的積聚，導致腎小球硬化及腎間質纖維化，在DN中發(fā)揮重要作用［2-5］。經解毒通絡保腎膠囊干預后，大鼠腎小球內表達的ColⅣ、FN明顯低于模型組，同時，經解毒通絡保腎膠囊干預后的大鼠血糖、腎功能、尿微量白蛋白均較模型組明顯改善，提示解毒通絡保腎膠囊可能通過減少腎組織中ColⅣ、FN含量，抑制腎小球ECM積聚，延緩DN的進展。

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［1］周靜波.糖尿病腎病蛋白尿的中醫(yī)藥治療研究［J］.長春中醫(yī)藥大學學報，2012，28(2):261-263.

［2］Levey A S，Coresh J，Balk E，et al.National Kidney Foundation practice guidelines for chronic kidney disease:evaluation，classification，and stratification［J］.Annals of internal medicine，2003，139(2):137-147.

［3］Dalla Vestra M，Saller A，Bortoloso E，et al.Structural involvement in type 1 and type 2 diabetic nephropathy［J］.Diabetes＆ metabolism，2000，26:8-14.

［4］Aumailley M.Structure and supramolecular organization of basement membranes［J］.Kidney international.Supplement，1995，49:4.

［5］劉楠梅.基質金屬蛋白酶-2與糖尿病腎病［J］.中華實用醫(yī)學，2003，5(16):72-74.

Influence of expression of ColⅣand FN in renal tissue intervened byJieDu TongLuo BaoShen Capsuleon diabetic nephropathy rat

WANG Xiuge，ZHAO Jinxiang，PIAO Chunli，CHEN Xi，GAO Linhua
(Changchun University of Chinese Medicine Affiliated Hospital，Changchun 130021，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of expression ofⅣ collagen(ColⅣ)and fibronectin(FN)in renal tissue intervened byJieDu TongLuo BaoShen Capsuleon diabetic nephropathy rat.MethodsDiabetic nephropathy model in rats were duplicated by hyper-lipoid raised and STZ-injected.All rats were randomly divided into normal control group，model group，JieDu TongLuo BaoShen Capsulegroup，positive control group(rosiglitazone combined with benazepril).After 16 weeks，the expression level of ColⅣ and FN in glomerular were detected by immunohistochemical method.At the same time，the change of blood glucose，blood urea nitrogen，creatinine and urinary microalbumin were detected.ResultsThe expression of blood sugar，blood urea nitrogen，serum creatinine，urine microalbumin，ColⅣ and FN were markedly elevated in model group(P＜0.01).Compared with the model group，the expression of blood sugar，blood urea nitrogen，serum creatinine，urine microalbumin，ColⅣ and FN were significantly lower inJieDu TongLuo BaoShengroup(P＜0.01).ConclusionJieDu TongLuo BaoShen Capsulecan reduce the contents of ColⅣ and FN in renal tissue，inhibit the accumulation of ECM in glomerular，deloy the progress of diabetic nephropathy.

Key words:JieDu TongLuo BaoShen Capsule;diabetic nephropathy;CollagenⅣ;fibronectin

R285.5

A

2095－6258(2014)04－0598－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.04.013

吉林省科技廳自然科學基金項目(201015208)。

王秀閣(1966－)，女，教授，碩士研究生導師。研究方向:中醫(yī)藥治療內分泌疾病及其機制研究。

(

2014－03－28)