廖卓毅 馬秋月 戴曉港 張得芳 李淑嫻

(林木遺傳與生物技術省部共建教育部重點實驗室(南京林業(yè)大學)，南京，210037)

微衛(wèi)星序列(microsatellite or simple sequence repeats，SSR)是指以1～6個核苷酸為基本重復單位的串聯(lián)重復序列[1]。微衛(wèi)星廣泛分布于各種生物的基因組中，尤其是真核生物基因組中。在群體間和不同個體間，微衛(wèi)星序列均表現(xiàn)出很高的變異性，其在基因組中的位置決定了它的功能，能夠影響包括基因調控、發(fā)展和進化等各個方面。目前，SSR分子標記技術廣泛應用于植物遺傳多樣性分析、連鎖圖譜制作、疾病連鎖分析和品種鑒定等方面[2－4]。

目前，微衛(wèi)星在遺傳學領域得到了廣泛應用，隨著大規(guī)模物種基因組測序工作的開展，已經在脊椎和無脊椎動物(人類、蚊子、雞、斑馬魚和中國對蝦等)、植物(擬南芥、水稻和小麥等)以及一些原核生物等30個以上的物種進行了基因組微衛(wèi)星分布特征分析[5－9]。這些研究結果表明，不同物種微衛(wèi)星的分布特征存在著較大差異，微衛(wèi)星的突變率也不相同[10－11]，并且物種本身堿基組成也是選擇的結果。所以基于物種間基因組水平上微衛(wèi)星分布特征的比較分析，有助于從進化學的角度了解各重復類型分布特點及其功能。

核桃(Juglans regia L.)又名胡桃、合桃，屬于胡桃科核桃屬[12]，果實富含碳水化合物、油脂、維生素和礦物質，享有“長壽之果”的美譽，是理想的滋補食品。不同學者對核桃微衛(wèi)星已有了一定的研究，Woeste等[13]最早通過構建微衛(wèi)星文庫，從黑核桃中開發(fā)出30對SSR引物用于品種的鑒別;齊建勛等[14]通過檢索核桃EST序列，開發(fā)了40對EST－SSR引物。Dangl等[15]應用SSR標記對主要來自歐美的48份資源進行了遺傳多樣性分析和品種的SSR鑒定。Wang等[16]用8個SSR標記研究了核桃和鐵核桃天然居群的遺傳結構。劉秀麗等[17]用7個SSR標記對3個核桃群體的遺傳結構進行了分析，但從基因組水平上對核桃微衛(wèi)星進行分析還沒有報道。本研究利用Roche—454GSFLX高通量測序平臺，對核桃進行低覆蓋度的基因組測序，并分析其微衛(wèi)星序列組成及特征、微衛(wèi)星分布頻率和豐度，旨在為從基因組水平上了解核桃微衛(wèi)星進化和功能以及微衛(wèi)星標記的開發(fā)、品種的真實性鑒定研究等工作提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

試驗材料取自南京林業(yè)大學校園內。2012年春天采集剛萌發(fā)的嫩葉，采集后立即置于便攜式冰盒中帶回實驗室，置于冰箱中－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1 DNA提取及測序

基因組DNA的提取和提純采用植物DNA提取試劑盒DP305(上海玉博生物科技有限公司)。利用Roche－454GS FLX測序儀對核桃DNA樣品進行測序。

1.2 分析方法

測序后所得數(shù)據(jù)利用454自帶軟件Roche Newbler 2.7進行序列拼接。采用 Misa(www.pgrc.ipkgatersleben.de/misa)程序進行所有重復單元長度微衛(wèi)星的查找，其中參數(shù)設置為:單堿基重復最短為10個重復、二堿基重復最短為6個重復、三堿基重復最短為4個重復、四堿基重復最短為3個重復、五堿基重復最短為3個重復、六堿基重復最短為2個重復。不同重復單元微衛(wèi)星密度的計算:D=N/L。其中，D為不同重復微衛(wèi)星密度(個/Mb);N為各重復單元微衛(wèi)星數(shù)量(個);L為核桃基因組重疊群總長(Mb)。

2 結果與分析

2.1 測序及拼接結果

本研究利用Roche－454 FLX高通量測序后，共測得104.5 Mb的核桃基因組序列，序列總數(shù)為541176條，堿基總數(shù)為194024314 bp，平均讀長為358.5 bp。在所測得的序列中，CG堿基數(shù)為72563561 bp，CG堿基比例為37.41%。此外 Q20占總堿基百分比為85.5%。在高通量測序中，每測一個堿基就會給出一個相應的質量值，用以衡量測序的準確度，堿基的質量值為20，表示測序的錯誤率為1%，所以Q20含量是評價測序準確率的有效指標。本試驗中Q20所占總堿基百分比為85.5%，表明測序具有較高的準確度。

通過Roche Newbler 2.7軟件進行序列拼接和組裝，產生了143078個完全組裝序列，68799個部分組裝序列，320318個單一序列以及1622個重復序列。其中大于500 bp的重疊群有9707個，重疊群的最大長度為47928 bp，部分拼接數(shù)據(jù)見表1。

表1 有效讀長序列拼接結果

對核桃基因組進行測序查找，共獲得SSR序列9787條，核桃基因組部分微衛(wèi)星重復序列的信息見表2。

2.2 核桃基因組微衛(wèi)星豐度及分布密度分析

通過對核桃基因組進行隨機測序，從總長為9483541 bp的有效讀長中找到9787個微衛(wèi)星，平均每969 bp出現(xiàn)一個。對獲得的SSR進行密度分析，因各重復類型的長度不一，所得密度也存在較大差異。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在9787個核桃微衛(wèi)星中，六堿基重復為最多重復類型，共5883個，占總數(shù)的60.11%;其次是單堿基重復，1289個，占總數(shù)的13.17%;再次分別是四堿基重復、二堿基重復、三堿基重復和五堿基重復(表3)。

2.3 核桃基因組微衛(wèi)星的優(yōu)勢重復拷貝類型堿基組成分析

在單堿基重復中，A/T堿基為優(yōu)勢重復單元，共1268個，占單堿基重復序列總數(shù)的98.37%，C/G堿基重復占1.63%;二堿基中，重復單元最多的為AT/TA，共399個，占二堿基重復序列總數(shù)的51.95%，其次是AG/CT和AC/GT，分別為278個(36.20%)和88 個(11.46%)，最少的 CG/GC，僅3 個，占總數(shù)的0.39%;在三堿基重復中，共發(fā)現(xiàn)9種重復單元，共計549個，其中AAT/ATT重復為181個，AAG/CTT重復151個，ATC/ATG重復72個，分別占三堿基重復序列總數(shù)的32.97%、27.50%和13.11%，三者共占總數(shù)的73.58%，其次是AGG/CCT重復為37個(6.74%)、ACC/GGT 重復 34 個(6.19%)、AAC/GTT重復 33個(6.01%)、ACT/AGT重復 21個(3.83%)、AGC/CTG 重復 16 個(2.91%)，最少的為ACG/CGT重復，僅4個，占0.73%;在889個四堿基重復中，AAAT/ATTT最多，共293個，占四堿基重復總數(shù)的32.96%，其次是AAAG/CTTT，共106個，占總數(shù)的11.92%，另外AATG/ATTC重復57個(6.41%)，AATT/AATT 重復 49 個 (5.51%)，AAAC/GTTT重復 47個(5.28%)，ACAT/ATGT 重復、ATGC/ATGC重復和AGCT/AGCT重復均為41個(4.61%)，AGGG/CCCT 重復、AAGG/CCTT 重復和AATC/ATTG重復分別為26個(2.92%)、25個(2.81%)和24 個(2.70%);在五堿基重復中，總共25種重復類型，其中 AGATG/ATCTC重復和AAAAT/ATTTT重復為最多重復單元，分別為79個(19.31%)和 77 個(18.82%)，其次是 AAAAG/CTTTT，為37 個(9.05%)，另外，AAATG/ATTTC 重復18個(4.16%)、AAAAC/GTTTT重復17個(4.16%)、AATAT/ATATT 重復17個(4.16%)、ACCGG/CCGGT重復17個(4.16%)、ATATC/ATATG

重復14個(3.42%)、AACTC/AGTTG重復13個(3.41%)、AACAT/ATGTT 重復和 ACCCG/CGGGT重復均為11個(2.69%)，剩余其他重復單元較少;在5883個六堿基重復微衛(wèi)星中，重復單元類型多達118種，各重復單元所占總數(shù)的比例都很小，其中以AAAAAT/ATTTTT重復和AAAAAG/CTTTTT重復最多，分別為390個和299個，占總數(shù)的6.63%和5.08%，其它幾種含量較多的六堿基重復拷貝類型中，AAAAAC/GTTTTT重復(145個)、AAAATT/AATTTT重復(129個)、AAAATC/ATTTTG重復(114個)、AAATAT/ATATTT重復(114個)、AAAGAG/CTCTTT重復(101個)、AAGAGG/CCTCTT重復(94個)、AAATTG/AATTTC重復(93個)、AAAAGG/CCTTTT重復(80個)依次減小。

總體而言，在核桃基因組微衛(wèi)星序列中，六堿基重復是最豐富的微衛(wèi)星類型，其次是單堿基重復。對這6種微衛(wèi)星重復類型進行統(tǒng)計分析，我們還發(fā)現(xiàn)，五堿基重復微衛(wèi)星中AGATG和AAAAT是最多的兩類，而單堿基重復微衛(wèi)星中，A/T占總數(shù)的98.37%;同樣，二、三、四和六堿基重復微衛(wèi)星中，含量最多的分別是AN、AAN、AAAN和AAAAAN(N表示除A堿基外的其他任何堿基)?？偟膩碚f，核桃微衛(wèi)星中富含A和T堿基。

表2 核桃微衛(wèi)星數(shù)據(jù)庫的部分結果

表3 不同長度重復單元微衛(wèi)星所占比例及分布密度

2.4 核桃基因組微衛(wèi)星長度分布及變異分析

本研究中核桃基因組微衛(wèi)星的平均長度為21.86 bp，最長578 bp，最短10 bp，這些微衛(wèi)星以10 ～20 bp 為主，長度≥20 bp的微衛(wèi)星僅占17.22%(圖1)。

圖1 核桃微衛(wèi)星長度分布及不同長度微衛(wèi)星頻率

進一步對SSR相對豐度與重復次數(shù)的關系進行分析，結果表明，核桃中SSR相對豐度隨著重復次數(shù)的增加而迅速下降，但不同基因序列長度類型的下降速度不同?？傮w看，單堿基重復次數(shù)超過17、二堿基超過19、三堿基超過8、四堿基和五堿基超過6、六堿基超過4之后，相對豐度就接近于零了。從柱狀數(shù)量變化還可以看出，二堿基重復微衛(wèi)星長度的變化次數(shù)明顯多于其它重復類型。在這些重復類型中，六堿基重復微衛(wèi)星長度的變化次數(shù)最少，這表明二堿基重復微衛(wèi)星的變異程度最高，六堿基重復的變異程度最低(表4)。

表4 6種重復類型中長度變異情況

3 結論與討論

在核桃總長為948354 bp的有效讀長中有9787個微衛(wèi)星，平均每969 bp出現(xiàn)1個微衛(wèi)星，分布密度為1032個/Mb。在已見報道的一些植物微衛(wèi)星密度中，油茶微衛(wèi)星密度為539.5個/Mb，楊樹基因組序列平均1883 bp出現(xiàn)1個微衛(wèi)星，分布密度為531.1個/Mb，均低于核桃微衛(wèi)星的分布密度。鄭燕[18]等對水稻、玉米、高粱和二穗短柄草4種禾本科植物SSR的對比研究發(fā)現(xiàn)，不同植物的基因組中，SSR的積累速度及進化速度可能會有所不同，基因組中SSR數(shù)量與物種基因組大小有關，通過與其他植物已測定基因組序列的對比，可以為核桃基因組的測序工作提供有益幫助。

目前大多數(shù)木本植物微衛(wèi)星的分析研究主要局限于少數(shù)微衛(wèi)星位點的實驗分析[19]，而大量微衛(wèi)星的生物信息學分析卻僅限于極少數(shù)幾個樹種，已完成整個基因組SSR測序的楊樹是為數(shù)不多的物種之一[20]。通過與楊樹微衛(wèi)星密度的對比，可以為核桃整個基因組微衛(wèi)星測序工作提供參考。本試驗對核桃基因組微衛(wèi)星進行了低覆蓋度的測序，結果表明，在核桃基因組微衛(wèi)星序列中，六核苷酸重復的比例在所有重復類型中最多，占60.11%。目前已完成測序的微衛(wèi)星生物信息學分析表明，玉米[16]、高粱[6]和楊樹[20]主要以三核苷酸重復為優(yōu)勢重復類型;有的生物，如人、擬南芥和秀麗隱桿線蟲則以單核苷酸重復為最優(yōu)[6，21];有些生物，如果蠅、家蠶等以二核苷酸重復為主[6－8]，而六核苷酸重復占優(yōu)的現(xiàn)象則極為罕見。筆者認為可能是由于本試驗只對核桃基因組微衛(wèi)星序列進行了低覆蓋度的測序，獲得的結果不夠全面所致，但確切的原因還有待進一步研究。已發(fā)表物種微衛(wèi)星序列特征的報道中，對于六核苷酸重復在生物中作用的研究還比較少，所以六核苷酸重復占優(yōu)勢對核桃遺傳學上的影響將是一個新的研究領域。

對核桃基因組微衛(wèi)星進行分析發(fā)現(xiàn)核桃基因組微衛(wèi)星中富含A和T堿基，而C和G的含量很少，但隨著重復單元長度的增加，C和G的含量也在增加。在單堿基重復中，A/T含量高達98.37%，二核苷酸重復中，A/T含量占51.95%，這與人、有胚植物、酵母和真菌類生物基因組微衛(wèi)星的分析結果類似[18]。隨著堿基長度的增加，C和G堿基可以增加堿基重復的穩(wěn)定性[22]，而微衛(wèi)星中富含A和T堿基，使得Tm值大大降低，DNA鏈容易解開，通過DNA復制滑動機制和重組機制，產生富含AT重復類型的機率更高。

本次還對核桃基因組不同單元類型微衛(wèi)星的長度變異情況進行了分析，發(fā)現(xiàn)這些微衛(wèi)星的長度變異與所含重復單元的長度成反比，除單核苷酸重復微衛(wèi)星外，這些微衛(wèi)星的長度變異程度隨著重復單元長度的增加而降低。Samadi等[23]的模擬分析研究認為重復單位長度越長，經受的選擇壓力越大，因此它們的拷貝數(shù)就越少，長度變異越低。由于序列長度的分化情況反映了不同類型微衛(wèi)星序列獲得或失去重復單元的速率，所以這一特征與微衛(wèi)星位點的多態(tài)性關系密切，這反映了由短重復單元構成的微衛(wèi)星失去或獲得重復單元的速率比長重復單元構成的微衛(wèi)星要快。閻毛毛等[24]在對楊樹、桉樹和松樹這3個樹種的SSR對比之后，得出了同樣的結果。這是否是林木表達序列所含微衛(wèi)星的共同的變化規(guī)律?這一假設還需要在更多的樹種中展開分析加以驗證。Temnykh等[25]將按長度將微衛(wèi)星分為兩大類:長度大于等于20 bp的SSR為第一類，長度大于12 bp但小于20 bp的為第二類。本試驗對9787個微衛(wèi)星的長度進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星長度從10 bp到578 bp不等，微衛(wèi)星的平均長度為21.86 bp，不同長度的微衛(wèi)星的數(shù)量差異極顯著，且不符合正態(tài)分布，微衛(wèi)星主要第一類為主，第二類僅為17.22%。與第二類SSR相比，第一類SSR具有更高的多態(tài)性。這一規(guī)律是 Weber[26]最早于人類的微衛(wèi)星實驗數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，并已在很多生物體中得到證實。第二類SSR由于片段長度較短，在滑鏈錯配時可產生的錯配位點就會相對較少，故多態(tài)性不如第一類，由于較長的微衛(wèi)星具有更高的變異頻率，因此會受到更強烈選擇的影響，這對于研究核桃基因組的起源時間具有重要的意義，其多態(tài)性也為核桃微衛(wèi)星位點的標記提供了可行性。

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