張彬，路陽，尹美強(qiáng)，溫銀元，趙娟，王玉國

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 山西 太谷 030801)

紫甘藍(lán)COP1基因的克隆及表達(dá)模式分析

張彬，路陽，尹美強(qiáng)，溫銀元，趙娟，王玉國

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 山西 太谷 030801)

光照是植物生長發(fā)育的一個(gè)重要的環(huán)境因素，COP1是光調(diào)控植物發(fā)育的一個(gè)分子開關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以“早紅”紫甘藍(lán)為實(shí)驗(yàn)材料，分兩組置于光照(光照16 h，28℃；黑暗8 h， 18℃)及完全遮光培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至幼苗時(shí)提取RNA，進(jìn)行COP1的cDNA克隆，并通過半定量RT-PCR方法分析COP1在不同處理下的表達(dá)情況。結(jié)果表明：COP1 cDNA全長為1863 bp，編碼620 aa，分子量為70.325 kD；在無光條件下生長的紫甘藍(lán)幼苗雖然仍有少量花青素合成，但是其花青素含量明顯低于光照條件下生長的紫甘藍(lán)幼苗；COP1基因在無光條件下的表達(dá)量明顯強(qiáng)于有光條件，表明COP1對(duì)紫甘藍(lán)中花青素的合成起負(fù)調(diào)控作用。本文旨在探索在不同光照條件下紫甘藍(lán)中COP1基因與其花青素合成的關(guān)系，為后期揭示花青素表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

紫甘藍(lán)；花青素；COP1；基因克隆；半定量RT-PCR

光是植物生長發(fā)育過程中一個(gè)不可缺少的環(huán)境因素，植物通過葉綠體在光照下完成光合作用，為植物生長提供養(yǎng)分，對(duì)植物幼苗的形態(tài)建成和生長發(fā)育起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)幼苗在有光條件生長時(shí)，會(huì)發(fā)生光形態(tài)建成[1，2]：即胚軸部縮短，子葉大且伸展，含有豐富且發(fā)達(dá)的葉綠體，幼苗去黃化；而當(dāng)幼苗在暗處生長時(shí)，其頂端彎曲，子葉小且不展，幼苗形成黃化質(zhì)體且葉綠體缺乏，稱為暗形態(tài)建成。利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法，鄧興旺實(shí)驗(yàn)室獲得了擬南芥COP1突變體并克隆了COP1(constitutively photomorphogenic 1)基因，它編碼的蛋白COPl是光調(diào)控植物發(fā)育的一個(gè)分子開關(guān)(molecular switch)。在暗環(huán)境中COP1蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)，參與泛素化降解光信號(hào)途徑中的正調(diào)控因子HY5，抑制植物的光形態(tài)建成；而在光照下，COP1在植物分散到細(xì)胞質(zhì)中，從而使得植物光形態(tài)建成恢復(fù)。在核內(nèi)，COP1與多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子作用共同調(diào)節(jié)植物的形態(tài)建成[3，4]。在高等綠色植物中，COP1基因首次從擬南芥中分離并鑒定了其功能[5]，除擬南芥外，現(xiàn)已從菊目[6](向日葵，萵苣)、蕪菁[7]、可可[8]、豌豆[9]、甘藍(lán)型油菜[10]等植物中獲得cDNA的克隆及功能研究，并研究了COP1在水稻中時(shí)空表達(dá)分析[11]。甘藍(lán)為世界性栽培蔬菜，在中國各地均有栽培，特別是東北、西北、華北等較冷地區(qū)春、夏、秋的主要蔬菜。紫甘藍(lán)為甘藍(lán)的一種，且富含花青素，即甘藍(lán)的主要價(jià)值體現(xiàn)在食用、藥用及觀賞價(jià)值上。本文就紫甘藍(lán)置于不同光照處理下COP1基因表達(dá)模式進(jìn)行初步研究，旨在探索不同光照處理下COP1對(duì)高花青素含量蔬菜紫甘藍(lán)的作用機(jī)理，為后期揭示花青素表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)采用的紫甘藍(lán)種子購自重慶天子種業(yè)有限公司；RNA提取試劑盒RNAiso Plus，Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶等均購自大連TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV RT、DNA消化酶RQ1 Rnase-Free Dnase采用Promega公司的產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)是北京TIANGEN公司產(chǎn)品；抗生素購自Sigma公司；Marker DL5000+購自北京天為時(shí)代科技有限公司。其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純?cè)噭?。引物合成和基因測(cè)序均由上海英駿生物技術(shù)公司完成?？寺≥d體pMD18-T為TaKaRa的公司產(chǎn)品。大腸桿菌菌株DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 植物材料

將“早紅”紫甘藍(lán)種子分兩組，一組置于光照(光照16 h，28℃)與黑暗(黑暗8 h， 18℃)培養(yǎng)箱，另一組放到密閉盒子后置于光照培養(yǎng)箱底層進(jìn)行遮光處理(無光)培養(yǎng)。兩種處理的紫甘藍(lán)種子均播種于含3層紗布的組培瓶中，將紗布、蒸餾水、組培瓶提前進(jìn)行高溫高壓滅菌，種子用75%的乙醇消毒，之后用已滅菌的蒸餾水沖洗多次播種。當(dāng)幼苗長至一定高度時(shí)取材(圖1)。

1.3 RNA的提取

分別稱取新鮮幼苗1 g，放入用液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮并研磨至粉末狀，按照TaKaRa公司RNA提取試劑盒RNAiso Plus說明書的操作來提取各材料中的總RNA。

圖1 紫甘藍(lán)在光照和避光培養(yǎng)生長狀況

1.4 cDNA的合成

以2 μg總RNA為模板，按照Promega公司M-MuLV RT反轉(zhuǎn)錄酶的說明書，使用本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的反轉(zhuǎn)錄引物dT-R進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。

1.5 COP1基因的克隆與測(cè)序

根據(jù)GenBank已登錄的其它物種COP1基因序列，按照同源基因克隆的方法，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)全長克隆引物：上游QCOP1-F：5-TAGGAAGGATCCGCTAGTT-3，下游QCOP1-R：5-AAAGTGGAACAAGAAATCATC-3。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，利用高保真酶Primer Star來擴(kuò)增目標(biāo)基因。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃復(fù)性30 s，72℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將切膠回收的DNA片段連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，Amp篩選，PCR鑒定片段大小后送樣測(cè)序。

1.6 COP1基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI的ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) 來分析開放閱讀框；利用CLUSTALX和MEGA 4.0對(duì)紫甘藍(lán)、蕪菁、擬南芥、油菜、蓖麻、毛白楊、豌豆、苜蓿、番茄、蘋果COP1的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)；利用ExPASy(http://www.expasy.org/vg/index/Protein)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)；利用MEGA 4.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.7 半定量RT-PCR分析紫甘藍(lán)光照及遮光處理下COP1在幼苗中的表達(dá)情況

根據(jù)已克隆的紫甘藍(lán)COP1基因序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)半定量RT-PCR引物：上游COP1F：5′-TCCAGAAGAGGCGTCAGT-3′，下游COP1R：5′-CATCTCGAAACACCAGCA-3′。以看家基因EF1A作為內(nèi)參基因(EF1A-F：5-ATCCCGTTGCTTTCACTGC-3， EF1A-R： 5-CCGTACACATCCTGGTTTC-3)。將反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋3倍作為模板，利用普通rTaq酶擴(kuò)增目的基因片段及內(nèi)參基因。通過不同循環(huán)數(shù)下擴(kuò)增，得到最優(yōu)擴(kuò)增循環(huán)，28循環(huán)，在此循環(huán)下進(jìn)行EF1A和COP1的擴(kuò)增，反應(yīng)程序設(shè)置為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，調(diào)整EF1A擴(kuò)增產(chǎn)物上樣量，使得在光照和暗處兩處理下EF1A亮度達(dá)到一致，以該上樣量分別檢測(cè)COP1擴(kuò)增產(chǎn)物，分析兩個(gè)處理下COP1的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫甘藍(lán)cDNA的合成與COP1基因的克隆

提取的RNA電泳圖條帶清晰完整，28S與18S的條帶亮度比約為2∶1，表明RNA的質(zhì)量很高，符合實(shí)驗(yàn)要求，可以用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以提取的光照和黑暗處理的紫甘藍(lán)幼苗RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，用特異性全長引物QCOP1-F/QCOP1-R擴(kuò)增目的基因COP1，電泳圖顯示分別克隆得到約2.2 kb的片段(圖2)。將目的片段連接到pMD18-T載體中。PCR鑒定結(jié)果表明特異性引物分別擴(kuò)增得到約2.2 kb的目的片段，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，證明目的片段已經(jīng)成功連入pMD18-T載體中。送樣測(cè)序。

2.2 紫甘藍(lán)COP1基因特征分析

測(cè)序結(jié)果表明，從光照和黑暗培養(yǎng)下的紫甘藍(lán)cDNA克隆都得到了長度為2234 bp的cDNA序列，該序列包含了1863 bp的ORF(open reading frame，ORF)序列，編碼了620個(gè)氨基酸，分子量約70 kD，pI為7.30，見圖3。

圖2 COP1基因cDNA全長的RT-PCR擴(kuò)增

2.3 紫甘藍(lán)COP1基因的生物信息學(xué)分析

2.3.1 開放閱讀框以及蛋白質(zhì)保守位點(diǎn)分析

ORF Finder分析結(jié)果顯示紫甘藍(lán)的COP1基因由一個(gè)完整且連續(xù)的開放閱讀框組成；對(duì)紫甘藍(lán)、蕪菁、擬南芥、油菜、蓖麻、毛白楊、豌豆、苜蓿、番茄、蘋果進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)紫甘藍(lán)、青甘藍(lán)COP1蛋白與多種植物的COP1有很高的同源性，COP1蛋白的保守位點(diǎn)見圖4。

2.3.2 氨基酸組成以及理化性質(zhì)分析

紫甘藍(lán)COP1編碼了620個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為70 325.2，等電點(diǎn)(pI)為7.30；蕪菁COP1編碼了677個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為76 468.0，等電點(diǎn)為6.39；油菜COP1編碼了677個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為76 468.0，pI為6.39；擬南芥COP1編碼了675個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為76 187.6，pI為6.38。

2.3.3 蛋白質(zhì)親疏水性分析

通過在線軟件ExPASy中的ProtParam工具對(duì)紫甘藍(lán)、蕪菁、油菜及擬南芥COP1的親疏水性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示紫甘藍(lán)COP1的GRAVY(Grand average of hydropathicity)值為-0.530；蕪菁COP1的GRAVY值為-0.554；油菜COP1的GRAVY值為-0.554；及擬南芥COP1的GRAVY值為-0.556。以上結(jié)果說明這4個(gè)蛋白都是親水性的。

圖3 紫甘藍(lán)COP1全長 cDNA核苷酸序列及其蛋白質(zhì)序列

圖4 多種植物COP1蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)比較

2.3.4COP1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過MEGA 4.0對(duì)不同科屬的作物進(jìn)行了COP1進(jìn)化樹分析，如圖5所示，結(jié)果顯示甘藍(lán)與蕪菁、油菜親緣關(guān)系最近。

圖5 COP1蛋白在紫甘藍(lán)及相近物種的進(jìn)化系統(tǒng)圖

2.4 紫甘藍(lán)光照和黑暗處理下COP1表達(dá)情況分析

利用半定量RT-PCR方法分析紫甘藍(lán)幼苗在光形態(tài)建成和暗形態(tài)建成過程中COP1 的表達(dá)豐度(圖6)。圖1結(jié)果表明：不同光照條件下幼苗的形態(tài)差異很大，光照條件下生長的紫甘藍(lán)幼苗中因積累了大量的花青素而呈現(xiàn)為紫紅色(電子版)，而黑暗條件下生長的紫甘藍(lán)幼苗雖仍有少量花青素積累，但其花青素含量顯著低于光照條件下生長的幼苗，因此呈現(xiàn)為淺紫色；半定量結(jié)果表明，在黑暗條件下COP1基因的表達(dá)量顯著強(qiáng)于光照條件下，這個(gè)結(jié)果與其表型相反，據(jù)此推測(cè)，紫甘藍(lán)中COP1基因的表達(dá)受光照的抑制，COP1基因?qū)ψ细仕{(lán)中花青素的合成起一個(gè)負(fù)調(diào)控的作用。

圖6 半定量RT-PCR分析紫甘藍(lán)光照和黑暗培養(yǎng)下COP1表達(dá)情況

3 討論

COP1蛋白是光形態(tài)建成的一個(gè)抑制子，是光調(diào)控植物發(fā)育的一個(gè)分子開關(guān)。當(dāng)植物在暗處生長時(shí)，核內(nèi)會(huì)積累有豐富的COP1蛋白，光形態(tài)建成受到抑制。分析表明光下生長的擬南芥幼苗中COP1蛋白的水平與黑暗中生長的擬南芥無明顯差異[12]，而本實(shí)驗(yàn)基于高花青素含量的紫甘藍(lán)品種，在一定時(shí)間光照及完全避光處理下考察COP1的表達(dá)與光形態(tài)建成的關(guān)系。

通過表型觀察，培養(yǎng)一段時(shí)間兩種幼苗的形態(tài)建成及花青素的含量由于受到光的影響呈現(xiàn)不同顏色，相對(duì)于光照培養(yǎng)的正?；ㄇ嗨睾孔细仕{(lán)幼苗，遮光處理下幼苗花青素含量急劇降低，但在胚軸上端及子葉部分仍有部分花青素積累而呈淺紫色。而黑暗條件下COP1基因表達(dá)卻強(qiáng)于光照條件下，表型結(jié)果與半定量RT-PCR結(jié)果表明，光照能極大影響紫甘藍(lán)花青素的合成與積累，推測(cè)可能是在黑暗條件下，由于COP1在核內(nèi)通過參與泛素化降解光信號(hào)途徑中的正調(diào)控因子，抑制植物的光形態(tài)建成，而光照又是植物合成花青素的前提，但仍有少量花青素合成，推測(cè)可能在花青素合質(zhì)中，恢復(fù)了光形態(tài)建成，也可能被一些調(diào)控因子所分解，使得光照下COP1表達(dá)量低于黑暗處理下。前人對(duì)COP1功能研究僅限于WD-40重復(fù)結(jié)構(gòu)域的相互作用而抑制所有啟動(dòng)子中含有G-box 的光誘導(dǎo)基因的表達(dá)活性[13]。對(duì)COP1與紫甘藍(lán)中花青素合成途徑關(guān)系的作用機(jī)理還未曾報(bào)道。

李亞麗等[14]研究發(fā)現(xiàn)，紫甘藍(lán)中結(jié)構(gòu)基因的強(qiáng)表達(dá)利于花青素的合成與積累。而結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)差異主要發(fā)生在花青素合成途徑的中、下游。因此，后續(xù)研究可以進(jìn)一步探索COP1基因?qū)ㄇ嗨睾铣赏緩礁鹘Y(jié)構(gòu)基因的作用位點(diǎn)，及調(diào)控花青素與光形態(tài)建成的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)紫甘藍(lán)花青素合成代謝的影響。

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CloningandExpressionPatternAnalysisofPurpleCabbageCOP1Gene

Zhang Bin, Lu Yang, Yin Meiqiang, Wen Yinyuan，Zhao Juan, Wang Yuguo

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

Light is the most influential environmental factor, affecting the plant growth and development, otherwiseCOP1 is a molecular switch of light regulation for the plant development. In this experiment, "Zaohong" purple cabbage as experimental material, is divided into two groups placed in the light (light 16 h, 28℃; dark 8 h, 18℃) and completely shading incubator. RNA was extracted when it grew to seedlings, the cDNA ofCOP1 gene was cloned. We analyzedCOP1 expression pattern under different processing by semi-quantitative RT-PCR method. The full-length cDNA sequence ofCOP1 was 1863 bp, encoding 620 amino acids, with a molecular weight of 70.325 kD. Specially, the purple cabbage seedling still produce anthocyanins in dark conditions, and the content of anthocyanins of the purple cabbage seeding grown in dark conditions significant lower than the seeding grown in light conditions. The expression level ofCOP1 gene in dark conditions is clearly higher than that in light conditions, it indicated thatCOP1 gene played a negative regulatory role to the synthesis of anthocyanins in purple cabbage. The purpose of this paper is to explore the relationship between the synthesis of anthocyanin andCOP1 gene under the different illumination condition in the purple cabbage, and to lay the foundation for revealing anthocyanins expression regulation mechanism.

Purple cabbage；Anthocyanin；COP1；Gene cloning；Semi-quantitative RT-PCR

2014-06-24

2014-07-10

張彬 (1982-)，女(漢)，山西太原人，講師，博士，研究方向：植物生理與分子生物學(xué)。

山西省青年科技研究基金(2013021024-2)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金(201302)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才博士啟動(dòng)基金(2012YJ12)

Q785；S635

A

1671-8151(2014)05-0385-06

(編輯：武英耀)