王秀然，康立恒，安 偉，郝芳芳，陳 思，許春曉，盧天成，周曉麗

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部，吉林 長春 130021；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春 130021；4.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130122）

布魯菌病是一種人畜共患疾病，該病不但嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展，對人類健康也構(gòu)成了巨大威脅.人畜布魯菌病難以防控的原因是多方面的，其中，其致病機(jī)理（包括胞內(nèi)寄生機(jī)理）和免疫機(jī)理不清楚是主要原因.

引起布魯菌病的布魯菌是兼性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性球桿菌，不產(chǎn)生芽孢和莢膜.雖然布魯菌不能自主運(yùn)動(dòng)，但其攜帶組裝鞭毛的所有基因，也不含趨化系統(tǒng)［1］.脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是布魯菌主要的毒力因子，也是引起哺乳動(dòng)物免疫的主要抗原之一［2］.目前布魯菌脂多糖合成的途徑并不完全清晰，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與布魯菌脂多糖合成相關(guān)的關(guān)鍵基因有wbkA，gmd，wzm，wzt，wbkB，wbkC等，其中wzt基因?yàn)锳BC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（ABC transporter）的重要組成部分［3］，布魯菌LPS－O側(cè)鏈的合成即是通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)途徑.有研究顯示［4］，線性O(shè)多糖大多是通過這一途徑完成的，這一過程中糖苷連接到UDP－PP－糖鏈上，在細(xì)胞膜內(nèi)膜上完成聚合物的合成，然后借助ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)到膜外，鏈接到核心寡糖和類脂A上；其中，wzt基因編碼ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)體（ATP酶結(jié)構(gòu)域）O抗原輸出系統(tǒng)ATP結(jié)合蛋白，其突變導(dǎo)致B.melitensis 16M形成粗糙型突變體，ELISA檢測S－LPS的O側(cè)鏈可確定O側(cè)鏈缺失.O多糖合成前體由wzt形成的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通過十一異戊烯聯(lián)聚合物轉(zhuǎn)移到膜，在那里它被連接到脂質(zhì)A核心和易位到外膜的周質(zhì)面［5］.ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在細(xì)菌中是一個(gè)主要的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器，由一系列同源基因編碼的操縱子組成［6］.該操縱子由ATP結(jié)合蛋白、膜蛋白、亞基結(jié)合蛋白3部分組成，通常情況下，形成由6個(gè)跨膜片段組成的2個(gè)完整的膜蛋白［7］.ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是膜外生物大分子合成的主要運(yùn)輸通道之一，參與胞外多糖的合成［8］.此外，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在細(xì)菌營養(yǎng)成分的運(yùn)輸、獨(dú)立分子的外排等過程中也起著重要的作用［9］.研究發(fā)現(xiàn)，wzt基因缺失會(huì)造成布魯菌O側(cè)鏈缺失，同時(shí)降低布魯菌的毒力［10］；缺失wzt基因的布魯菌突變株與親本株相比，細(xì)胞免疫水平下降，體液免疫水平上升［11－12］.

本研究對源于布魯菌的wzt基因進(jìn)行了克隆并對原核進(jìn)行了表達(dá)，對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測，以為闡明布魯菌wzt基因的功能提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌株及載體

布魯菌Brucella abortus S19DNA、感受態(tài)菌株Eschericholia.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所五室贈(zèng)送；Trans－T1感受態(tài)、原核表達(dá)載體pEASY－E1expression kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

液體LB培養(yǎng)基：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl 1g，蒸餾水100mL，pH＝7.2.

固體培養(yǎng)基（Ampicillin，Ampr）：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl 1g，瓊脂1.5g，蒸餾水100mL，pH＝7.2.121℃滅菌20min.滅菌后加除菌的氨芐西林至100μg／mL.

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank中B.abortus S19的序列信息設(shè)計(jì)引物.上游引物（Nde I酶切位點(diǎn)）F：catatgATGATCCAGCCATCGATTACCCTGT；下游引物R（Xho I 酶切位點(diǎn)）：ctcgagTCATGCTATAGCTCCCATTCCCGAG.引物由長春華大中天生物技術(shù)有限公司合成.

1.2.3 wzt基因的擴(kuò)增

以B.abortus S19總DNA為模板，反應(yīng)體系50μL：模板DNA 2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，Ex Taq酶0.5μL，10×Buffer 5μL，dNTP 4μL，水36.5μL.反應(yīng)條件：94℃5min；94℃1min，58℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min.

1.2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

利用凝膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物與pEASY－E1載體連接并轉(zhuǎn)化Trans－T1感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后加入250μL經(jīng)室溫平衡的LB培養(yǎng)基，于37℃，180r／min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1h.取200μL菌液均勻地涂布于準(zhǔn)備好的Ampr固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜.

挑取單菌落接種于LB（Amp）液體培養(yǎng)基中，180r／min，37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12h，采用載體正向引物（E Control Forward Primer：GGAATTGTGAGCGGATAACAATTCC）和下游引物R進(jìn)行PCR鑒定.

提取陽性菌液質(zhì)粒，進(jìn)行Nde I和Xho I雙酶切鑒定，37℃水浴鍋酶切3h.酶切體系：質(zhì)粒4μL，限制性內(nèi)切酶Nde I 0.5μL，限制性內(nèi)切酶Xho I 0.5μL，Buffer 1μL，無菌水4μL.將鑒定正確的質(zhì)粒pEASY－wzt進(jìn)行測序.

1.2.5 誘導(dǎo)表達(dá)

將pEASY－wzt轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）.挑取陽性單克隆菌落，接種到5mL含有Amp的抗性LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180r／min培養(yǎng)6h；至菌液D（600）為0.6時(shí)，加入終濃度為1mmol／L 的IPTG，37℃繼續(xù)誘導(dǎo)4h.

1.2.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE電泳）分析

收集1.5mL誘導(dǎo)的菌液，以未誘導(dǎo)菌液作為陰性對照，于室溫12000r／min離心1min，棄上清，用1mL PBS懸?。?2000r／min離心1min，用50μL蒸餾水懸浮沉淀，加入50μL 2×SDS Buffer，在沸水中孵育5～10min.12000r／min離心5min，取上清液進(jìn)行8%SDS－PAGE電泳分析.凝膠用考馬斯亮藍(lán)R－250染色.

1.2.7 表達(dá)蛋白質(zhì)的純化

收集100mL誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，4℃，5000r／min離心5min；棄上清，加入100mL的PBS洗滌菌液，4℃，5000r／min離心5min；重復(fù)洗滌一次，棄上清，將菌體置于冰水中，用20mL的Binding Buffer結(jié)合液進(jìn)行重懸.超聲裂解細(xì)菌，超聲10s，間歇10s，功率400W持續(xù)工作30min，直至上清液變清澈.4℃，13000r／min離心10min，取上清，經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后，用1mL HisTrapTMFF親和層析柱純化蛋白.

1.2.8 表達(dá)產(chǎn)物的Western Blotting鑒定

純化產(chǎn)物經(jīng)SDS－PAGE分析后，根據(jù)SDS－PAGE凝膠的大小，剪裁PVDF膜和濾紙.將濾紙放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中完全浸透；PVDF膜先在甲醇中敏化15s，隨后放入蒸餾水中浸泡2min.組裝轉(zhuǎn)膜裝置，從陽極到陰極依次為：8層濾紙－PVDF膜－凝膠－8層濾紙.PVDF膜要略大于凝膠，以保證所有蛋白能夠轉(zhuǎn)到膜上；并將濾紙、凝膠、PVDF膜對齊，趕走氣泡.恒流110mA，電壓控制在25V內(nèi)，電轉(zhuǎn)25min.用洗滌液清洗PVDF膜3次，每次5min.加入5%脫脂奶粉常溫封閉，在搖床上輕輕搖動(dòng)1～2h.倒掉封閉液，用洗滌液洗膜3次，每次5min.一抗孵育：加入1∶200（體積比）倍稀釋的鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體，37℃孵育2h，倒掉一抗，洗滌液洗膜（方法同上）；二抗孵育：加入1∶2000（體積比）倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃孵育2h.倒掉二抗，洗滌液洗膜（方法同上）［13］.加入TMB顯色液顯色10min，加純水終止，掃描保存圖片.

1.3 wzt基因表達(dá)產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測

1.3.1 wzt蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用Discovery Studio 2.5軟件以Swiss－Model模式對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測［14］.

1.3.2 wzt基因表達(dá)產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中對與wzt基因功能相關(guān)的蛋白序列進(jìn)行檢索，并采用Clustalx1.83和MEGA5.0進(jìn)行生物信息學(xué)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 wzt基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

以B.abortus S19總DNA為模板，PCR擴(kuò)增wzt基因，成功獲得目的基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查，得到與目的基因大小相符的約756bp的條帶（見圖1）.

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定

將重組質(zhì)粒pEASY－wzt經(jīng)Xho I單酶切、Nde I和Xho I雙酶切進(jìn)行鑒定，得到的結(jié)果同理論值相符，表明重組表達(dá)質(zhì)粒pEASY－wzt構(gòu)建正確.經(jīng)測序，與GenBank注冊序列一致.

圖1 目的基因wzt的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖

圖2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pEASY－wzt轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL21中，加入IPTG使其終濃度為1.0mmol／L，37℃，誘導(dǎo)4h.通過8%SDS－PAGE分析鑒定，表明重組質(zhì)粒能夠成功表達(dá)目的蛋白，在相對分子質(zhì)量約28000處可見差異蛋白條帶，與理論值相符（見圖2），表明wzt基因成功表達(dá).

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化

SDS－PAGE結(jié)果表明，蛋白表達(dá)成功，經(jīng)親和層析純化可獲得純化的重組蛋白，經(jīng)Lowry法測定純化蛋白的質(zhì)量濃度為0.43mg／mL.

2.5 目的蛋白的鑒定

Western Blotting分析顯示，在相對分子質(zhì)量約28000處可見特異反應(yīng)條帶（見圖3），表明純化的重組蛋白能被His標(biāo)簽單克隆抗體所識(shí)別，表明所表達(dá)蛋白為wzt蛋白.

圖3 純化產(chǎn)物的Western blot分析

圖4 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖

2.6 wzt編碼蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測

由Discovery Studio 2.5生成、通過Swiss－Model構(gòu)建的結(jié)構(gòu)示意圖見圖4.模板選擇1oxv，與來自Sulfolobus solfataricus的蔗糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的ABC－ATP酶的序列一致性僅23.11%.三維構(gòu)象顯示，該蛋白可能由8個(gè)α螺旋、7個(gè)β片層構(gòu)成.

圖5 wzt基因及部分功能相同的基因編碼的蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.7 wzt編碼蛋白的同源性分析

將wzt基因編碼的蛋白序列與GenBank中功能相關(guān)的基因序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白質(zhì)序列在多數(shù)種屬中具有較高的種屬特異性.布魯菌屬不同種的該基因蛋白同源性接近100%（見圖5），與其他種屬相關(guān)蛋白的差異較大，但與耶爾森氏菌的O：9菌株的該蛋白序列同源性較高.

3 討論

布魯菌是一種重要的人畜共患病病原，其LPS既是其主要的毒力因子，同時(shí)也是引起免疫的重要抗原，wzt基因作為其合成的關(guān)鍵基因，在O多糖跨膜合成過程中起著重要的作用.

O多糖是在內(nèi)膜上由糖基轉(zhuǎn)移酶催化形成的脂質(zhì)鏈接的O側(cè)鏈重復(fù)單位，可通過某種機(jī)制將脂質(zhì)鏈接的O多糖傳遞到細(xì)胞周質(zhì)空間，并將O多糖鏈接到核心寡糖上形成LPS［5］.在細(xì)菌中參與O多糖合成的基因往往形成RFB基因［15－16］，RFB基因編碼合成新型糖苷前體的糖基轉(zhuǎn)移酶，作為運(yùn)輸過程所需要的酶，因此，RFB基因座位的多態(tài)性影響O多糖的結(jié)構(gòu)多樣性［17］.

目前已知有3種途徑參與O多糖的合成運(yùn)輸過程，分別為WZY依賴型途徑、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)型和合酶依賴型途徑.在WZY依賴型途徑中，由wzx蛋白同源類似物完成跨膜運(yùn)輸；而在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)型途徑中則由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子完成運(yùn)輸，其ATP結(jié)合域的序列高度保守，特別是核苷酸結(jié)合區(qū)［18］.本研究的結(jié)果顯示，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的wzt蛋白、ATP結(jié)合域，在布魯菌中具有高度保守的種屬特異性，因此ATP結(jié)合域的保守性具有屬的特異性.目前，有關(guān)O多糖合成的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子的確切組織形式和模式尚未見報(bào)道，沒有結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)可以參考，大部分信息是來自大腸桿菌等細(xì)菌的2型莢膜合成過程的研究和假說［18－19］.本研究發(fā)現(xiàn)wzt蛋白具有8個(gè)α螺旋、7個(gè)β片層結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步研究ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的組織形式及形成模式提供了依據(jù).

本研究成功表達(dá)了wzt蛋白，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步的預(yù)測，研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示wzt基因在LPS合成過程中的作用機(jī)制，闡述其在細(xì)菌組成物質(zhì)的合成和免疫調(diào)節(jié)中的作用具有重要的意義.

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