呂寧 戴海龍 尹小龍

先天性心臟病相關性肺動脈高壓患者血 miR-18a、miR-27b、miR-130a、miR-204水平研究

呂寧 戴海龍 尹小龍

目的 探索先天性心性臟病相關性肺動脈高壓（PAH）患者血清中miR-18a、miR-27b、miR-130a和 miR-204的表達水平，以及與PAH的相關性。方法 收集昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院心血管內(nèi)科2012年4～12月被確診為先天性心臟病的患者78例，其中肺動脈壓正常組37例，合并輕、中度肺動脈高壓組25例，重度肺動脈高壓組16例；另設正常對照組20例。應用實時熒光定量PCR（Taqman探針法）檢測miR-18a、miR-27b、miR-130a、miR-204在血液中的表達水平，分析先天性心臟病相關性肺動脈高壓與miRNA表達水平之間的關系。結果 先天性心臟病相關肺動脈高壓患者血miR-18a、miR-27b、miR-130a表達水平顯著上調(diào)，miR-204表達水平顯著下調(diào)。隨著肺動脈壓力的不斷增高，血miR-18a、miR-27b、miR-130a表達量明顯升高，miR-204表達量顯著下調(diào)。直線相關分析顯示，先天性心臟病繼發(fā)性肺動脈高壓患者血miR-18a、miR-27b、miR-130a 表達水平與肺動脈壓力存在高度正相關關系 （r=0.927，r=0.927，r=0.933，P＜0.01），miR-204表達水平與肺動脈壓力存在高度負相關關系（r=-0.773，P＜0.01）。結論 血miR-18a、miR-27b、miR-130a、miR-204水平可作為判斷先天性心臟病合并肺動脈高壓較好的臨床血清學指標，預判價值較高。

先天性心臟??；肺動脈高壓；微小RNA

先天性心臟病是胚胎時期心臟血管發(fā)育異常所導致的心血管畸形，是小兒最常見的心血管疾病。先天性心臟病在不同地區(qū)及種族的發(fā)病率為6‰～8‰[1,2]。先天性心臟病隨年齡增長發(fā)生心臟重構使得病情逐漸惡化，最終導致心力衰竭。

微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類進化上高度保守的單鏈非編碼RNA小分子，主要通過抑制mRNA翻譯或促進其降解來調(diào)控基因表達[3-5]。MiRNA特異表達于心血管生理和病理過程中，通過調(diào)控與細胞生長、分化、收縮及電傳導等密切相關基因的表達，在心血管發(fā)育及疾病中發(fā)揮重要作用。有研究提示，在原發(fā)性肺動脈高壓患者或先天性心臟病肺動脈高壓患者或缺氧和野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠模型肺組織中，miR-18a、miR-27b、miR-130a、miR-204 的表達水平異常[6-8]。本試驗研究血 miR-18a、miR-27b、miR-130a、miR-204與先天性心臟病肺動脈壓力的相關性，探討其與先天性心臟病肺動脈高壓的關系及診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院心血管內(nèi)科2012年4～12月收治確診為先天性心臟病患者78例，房間隔缺損（atrial septal defect，ASD）49 例、室間隔缺損（ventricular septal defect，VSD）29例，其中男性32例，女性46例。入選標準：先天性心臟病單純房間隔缺損或室間隔缺損，年齡＞14歲，未經(jīng)治療的患者。排除合并肺部疾病、冠心病、糖尿病、高血壓、心臟瓣膜病、心力衰竭的患者；合并甲狀腺疾病、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病及HIV感染的患者；合并嚴重肝、腎功能不全的患者。另設正常對照組20例。將研究對象分為正常對照組（A組，20例），肺動脈壓正常組（B組，37例），合并輕、中度肺動脈高壓組（C組，25例），合并重度肺動脈高壓組（D組，16例）。所有進入研究者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般生化檢查 入選對象于入院后次日清晨，在無菌操作下空腹抽取肘正中靜脈血5 ml裝入抗凝管內(nèi)，置入-70℃冰箱保存待測，避免反復凍融。同時抽取患者外周血送檢，由日本奧林巴斯全自動生化分析儀檢測，血生化檢查均正常。

1.2.2 心臟彩色超聲檢查及右心導管測壓 在行心臟超聲檢查時，一般要求患者取平臥位或左側臥位，暴露腰部以上區(qū)域，透視常選取主動脈根部短軸切面、心尖四腔心切面、胸骨旁四腔心切面和劍突下四腔心切面，記錄打印檢查結果。行右心導管術檢查，通過壓力延長導管檢測右室、肺動脈壓力，記錄壓力曲線。

1.2.3 樣 本 血 中 miR-18a、miR-27b、miR-130a、miR-204含量檢測 Trizol一步法提取血中總RNA。應用TaqmanRMicroRNA Reverse Transcription Kit和TaqmanRMicroRNA Assays試劑盒中特異性的莖-環(huán)狀反轉錄引物，進行反轉錄反應。按說明書操作，反應體系15 μl，反應條件：16℃30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。應用TaqmanRMicroRNA Assays試劑盒PCR引物探針混合液進行PCR擴增及熒光檢測。在熒光定量PCR儀上進行反應。按說明書操作，反應體系20μl，反應條件：95℃10min，95℃ 15 s及60℃ 1 min，后兩步共40個循環(huán)。為消除加樣誤差，每個反應平行設3個管重復3次。結束后得到每個樣本基因的擴增曲線和CT值。

1.3 統(tǒng)計學方法 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。試驗數(shù)據(jù)采用相對定量比較CT值法。在試驗前先檢測所有樣本RNU6B，然后計算每3個平行反應的平均CT值，通過目的基因相對含量=2-△△Ct得出每個待測基因的相對表達量。統(tǒng)計指標均進行正態(tài)性檢驗及方差齊性分析，因樣本不滿足正態(tài)分布（P＞0.05）和方差齊性條件（P＜0.05），所以選擇Kruskal-wallis H檢驗，多組間兩兩比較時應用Tamhane檢驗?；蛳鄬Ρ磉_量2-△△Ct值與肺動脈壓之間的關系采用Spearman等級相關法檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況比較 入選四組研究對象間年齡、性別比、房缺室缺比、射血分數(shù)均無差異（P＞0.05）。四組間臨床血液生化檢測指標比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。成人先天性心臟病以房間隔缺損多見，心臟擴大以重度肺動脈高壓多見。見表1。

表1 四組一般臨床檢測資料（±s）

表1 四組一般臨床檢測資料（±s）

注：TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；ALT：丙氨酸轉氨酶；AST：天冬氨酸轉氨酶；LVEF：左室射血分數(shù)

組別 TC（mmol/L）AST（U/L）TG（mmol/L）ALT（U/L）LVEF（%）A 組 4.62±0.21 1.07±0.05 29.10±1.37 28.12±1.11 77.30±3.43 B 組 4.74±0.18 0.98±0.02 30.21±2.48 29.70±0.95 67.60±4.45 C 組 4.69±0.19 1.16±0.03 30.83±1.55 29.63±1.71 62.90±2.73 D 組 4.70±0.16 1.05±0.03 31.50±1.27 31.50±1.27 57.00±4.71

2.2 血 miR-18a、miR-27b、miR-130a、miR-204 相對含量 血miR-18a、miR-27b、miR-130a和 miR-204在A組、B組、C組和D組中相對含量表達水平不同（P＜0.05）。與A組比較，D組、C組和B組miR-18a、miR130a表達水平顯著上調(diào)（P＜0.01），miR-204表達水平顯著下調(diào)（P＜0.01）；與B組比較，C 組和 D 組 miR-18a、miR130a、miR-27b表達水平顯著上調(diào)（P＜0.01），miR-204表達水平顯著下調(diào)（P＜0.01）；與 C 組比較，D 組 miR-18a、miR130a、miR-27b表達水平顯著上調(diào)（P＜0.01），miR-204表達水平顯著下調(diào)（P＜0.01）。見表2。

表2 四組血中miR-18a、miR-27b、miR-130a和miR-204的含量比較（±s）

表2 四組血中miR-18a、miR-27b、miR-130a和miR-204的含量比較（±s）

注：與 A 組比較，aP＜0.01;與 B 組比較，bP＜0.01;與 C 組比較，cP＜0.01

組別 例數(shù) miR-18a含量百分位數(shù)miR-204含量百分位數(shù)A組 20 1 1 1 1 B組 37 1.93（1.89～1.96）amiR-130a含量百分位數(shù)miR-27b含量百分位數(shù)0.94（0.89～0.98）aC組 25 2.14（2.11～2.18）ab2.16（2.08～2.20）a1.05（1.01～1.08）0.27（0.23～0.32）abD組 16 3.99（3.96～4.04）bc5.10（5.01～5.21）ab3.64（3.61～3.74）ab0.08（0.06～0.12）bc6.68（6.61～6.74）bc4.19（4.14～4.23）bc

2.3 血 miR-18a、miR-27b、miR-130a、miR-204 的相對表達量與肺動脈壓的相關性 直線相關分析顯示,先天性心臟病繼發(fā)性肺動脈高壓患者血miR-18a、miR-27b、miR-130a 表達水平與肺動脈壓存在高度正相關關系（r=0.927，r=0.927，r=0.933，P＜0.01），miR-204 表達水平與肺動脈壓存在高度負相關關系（r=-0.773，P＜0.01）

3 討論

MiRNA是一類內(nèi)源性單鏈小分子，由21～25個核苷酸組成，大部分由基因的內(nèi)含子部位產(chǎn)生，具有高度保守性、時序性和組織特異性，主要通過與特異mRNA結合，抑制mRNA翻譯或促進其降解，從而調(diào)控基因表達，調(diào)節(jié)人類1/3的基因。

MiRNA通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）的堿基互補來識別靶基因并在轉錄后水平調(diào)控其表達。因為miRNA與靶mRNA不完全互補配對，所以一個miRNA可以有多個靶基因，多個miRNA也可以共同調(diào)節(jié)同一靶基因，形成精密復雜的調(diào)控網(wǎng)路。所以，一個miRNA的錯誤表達就會擾亂大量蛋白質(zhì)的表達。

Brock等[6]研究提示，miR-17-9基因簇與肺動脈高壓相關，miR-17-9基因簇包括 miR-18a。Courboulin等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在非家族性原發(fā)性肺動脈高壓患者、缺氧和野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠模型肺組織中，miR-204、miR-27b表達異常，其中miR-204水平降低。進一步研究miR-204，發(fā)現(xiàn)其與肺動脈壓的嚴重程度相關，非家族性原發(fā)性肺動脈高壓患者血液中miR-204也是降低的。在野百合堿誘導的肺動脈高壓動物模型中，通過氣管內(nèi)噴霧法給予合成的miR-204，降低了肺動脈壓。陳偉丹等[8]對6例室間隔缺損合并重度肺動脈高壓患者的肺組織進行研究，發(fā)現(xiàn)與肺血管平滑肌細胞增殖相關的主要 miR-130a、miR-27b、miR-18a 表達顯著增高，提示這些miRNAs可能與先天性心臟病相關肺動脈高壓密切相關。

本研究在先天性心臟病相關性肺動脈高壓患者中，應用Taqman探針法實時定量PCR技術檢測血清中 miR-18a、miR-27b、miR-130a、miR-204 的相對表達量，發(fā)現(xiàn)與對照組進行比較，先天性心臟病繼發(fā)性肺動脈高壓患者血中miR-18a、miR-27b、miR-130a表達顯著增高，miR-204含量顯著降低。本研究提示，血 miR-18a、miR-27b、miR-130a、miR-204水平可作為判斷先天性心臟病合并肺動脈高壓較好的臨床血清學指標，預判價值較高。

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The changes of plasma miR-18a， miR-27b， miR-130a， miR-204 in patients with pulmonary arterial hypertension due to congenital heart disease

Lü Ning， DAI Hai-long， YIN Xiao-long.Department of Cardiology， Yan’an Hospital Affiliated to Kunming Medical College， Yunnan Cardiovascular Hospital， Kunming 650051， China

YIN Xiao-long， E-mail： yinxl001@gmail.com

Objective To detect the serum level of miR-18a， miR-27b， miR-130a and miR-204 in patients with pulmonary arterial hypertension due to congenital heart disease，and investigated the correlation of those with pulmonary hypertension.Methods 78 patients with congenital heart disease in the department of cardiology of Yan’an Affiliated Hospital of Kunming Medical University between April and Dcemeber 2012 and 20 normal control patients were collected.The patients with congenital heart disease were divided into 37 cases of nonpulmonary arterial hypertension group，25 cases of mild to moderate pulmonary arterial hypertension，and 16 cases of severe pulmonary arterial hypertension.The serum level of miR-18a， miR-27b， miR-130a and miR-204 were detected by using real-time fluoresecnt quantitative PCR（Taqman probe） ， and the relationship between serum miRNAs and pulmonary arterial pressure were analyzed and investigated the correlation between and PH.Results The expression level of miR-18a，miR-27b and miR-130a in CHD with PAH patients were significantly higherthan normal group， the expression level of miR-204 was significantly lower than normal group.The pulmonary arterial pressure was significant positively correlated with miR-18a， miR-27b， miR-130a （r=0.927，r=0.927，r=0.933， P＜0.01）.Conclusion The expression levels of miR-18a， miR-27b and miR-130a and miR-204 can be used as the good clinical serological indexes for diagnosis of patients with pulmonary arterial hypertension due to congenital heart disease.

Pulmonary arterial hypertension；Congenital heart disease；MicroRNA

昆明市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目；云南省博士研究生學術新人獎

650051 云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院云南心血管病醫(yī)院心內(nèi)科

尹小龍，E-mail：yinxl001@gmail.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.09.005

R541.1

A

1672-5301（2014）09-0785－04

2014-04-22）