李穎慶 盧建華 王西富 李欣 胡春林 廖曉星

臨床研究

心肌特異性miR-133a與cTnT早期診斷急性心肌梗死的價值

李穎慶 盧建華 王西富 李欣 胡春林 廖曉星

目的比較血循環(huán)中心肌特異性miR-133a與肌鈣蛋白T（cTnT）在急性心肌梗死（AMI）早期診斷中的價值。方法收集67例AMI患者和32名非AMI對照者的血漿標(biāo)本，通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）測定血漿中miR-133a水平，同時通過電化學(xué)發(fā)光法檢測血漿cTnT的變化。結(jié)果AMI患者血漿中miR-133a水平較非AMI對照者明顯升高（P＜0.01），而當(dāng)這些AMI患者康復(fù)出院時miR-133a水平已回落到基線。MiR-133a水平的波動與研究對象的自身特征無相關(guān)性（P＞0.05）。受試者工作特征曲線（ROC）分析表明，miR-133a在早期診斷AMI方面具有顯著的心肌特異性和敏感性，但并不優(yōu)于cTnT。結(jié)論血漿miR-133a可作為AMI早期診斷的標(biāo)志物，但在診斷價值上并不優(yōu)于cTnT。

miR-133a； 肌鈣蛋白T； 急性心肌梗死； 標(biāo)志物

就世界范圍而言,急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）已成為臨床主要的死亡原因，但是可以通過早期診斷、盡早干預(yù)，有效地降低AMI所致的高死亡率。目前在臨床診斷AMI時，肌鈣蛋白 T（Cardiac troponin T，cTnT）是早期診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，因為cTnT對心肌損傷具有高度的特異性和敏感性[1]。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)，終末期腎病患者cTnT的血漿濃度也明顯升高，可作為慢性腎功能衰竭的一項血漿標(biāo)志物[2]。因此，尋求對早期診斷AMI具有更高特異性的生物標(biāo)志物很有必要。

微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）是一族由19～25個核苷酸組成的內(nèi)源性、非編碼小RNA[3]，能夠調(diào)控基因表達(dá)，并在多個病理生理過程中發(fā)揮重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs具有組織及細(xì)胞特異性，并在各種狀態(tài)下對細(xì)胞及組織功能發(fā)揮重要作用[5]。特別是近期研究報道，在外周血漿中可檢測到miRNAs的存在，并可隨著機(jī)體病理生理狀態(tài)的改變發(fā)生相應(yīng)的表達(dá)變化，這表明miRNAs也許可以作為特定疾病的生物診斷標(biāo)志物[6]。已有研究顯示，AMI發(fā)生時，外周血漿中某些miRNAs的表達(dá)可發(fā)生相應(yīng)的變化，這表明心肌特異性miRNAs也許可作為AMI診斷的生物標(biāo)志物[7-11]。

本研究目的是通過檢測外周血漿中miR-133a和cTnT在AMI患者中的表達(dá)，分析miR-133a診斷AMI的可行性，并比較miR-133a與cTnT的診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 共有67例AMI患者納入本項研究，另外有32名非AMI志愿者作為對照。AMI的診斷依據(jù)最新的指南[12]：肌鈣蛋白（cTn）較99%正常上限升高/降低1倍以上，同時結(jié)合：①缺血性胸痛；②新出現(xiàn)的顯著ST段及T波改變或新出現(xiàn)的左束支傳導(dǎo)阻滯；③ECG出現(xiàn)進(jìn)展性的病理性Q波；④影像學(xué)證實新發(fā)的存活心肌丟失或室壁運動異常；⑤冠脈造影或尸檢證實有冠脈內(nèi)血栓。

1.2 血漿的采集和保存 研究組病例的靜脈血標(biāo)本（3 ml）分別在AMI癥狀出現(xiàn)后12 h內(nèi)和14 d時采集，由于病情變化的緣故，在第14天時有18例患者的血漿標(biāo)本納入研究；32名非AMI對照者的靜脈血標(biāo)本未區(qū)分時間段。所有靜脈血標(biāo)本均用EDTA抗凝管收集，4℃1000 g離心10 min以分離血漿。將分離出的血漿4℃14 000 g離心15 min，取上清液置于無RNA酶的EP管中，存儲于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總RNA抽提 血漿中總RNA采用TRIzol LSR試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）進(jìn)行抽提，操作過程參考相應(yīng)說明。提取的總RNA溶于10μl DEPC水中，RNA含量及濃度通過BioPhotometer（Eppendorf）進(jìn)行測定。

1.4 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）從每份血漿樣本抽提的總RNA中取0.5μg，加入miRNA特異性引物及M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega，Madison，WI，USA）構(gòu)成反應(yīng)體系，采用由瑞博公司（中國，廣東）提供的Bulge-LoopTMmiRNA qRTPCR專用引物進(jìn)行實時定量PCR檢測miR-133a的表達(dá)，操作過程參照相應(yīng)說明，加入秀麗桿線蟲miRNA（cel-miR-39）作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參[6]。反應(yīng)參數(shù)設(shè)定：①42℃，60 min；②70℃，10 min。最后將cDNA產(chǎn)物貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

運用PRISM 7900HT系列檢測系統(tǒng)（Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA） 進(jìn)行 qRT-PCR 反應(yīng)。20μl反應(yīng)體系中含有2μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，2μl前向引物（5μm），2μl通用PCR引物（5μm），9μl Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG reagent（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），5 μl超 純水。整個反應(yīng)體系先95℃孵育2 min，然后40個循環(huán)（95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s），再從 60 ℃加熱至95℃獲得相應(yīng)的融解曲線。反應(yīng)過程中未加入作為陰性對照逆轉(zhuǎn)錄酶或模板，每個反應(yīng)體系安排3個副孔。采用2-ΔΔCt法分析miR-133a基因的相對表達(dá)量[13]。

1.5 cTnT檢測 血漿cTnT含量測定應(yīng)用電化學(xué)免疫熒光法，具體過程參照2010免疫熒光電化學(xué)試劑盒（Roche Diagnostics，Switzerland）相應(yīng)說明書進(jìn)行，cTnT＜0.04 ng/ml定義為正常參考值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件包。所有數(shù)據(jù)除特殊標(biāo)注外，均采用±s的形式，AMI與對照組病例的臨床特征數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗或Fisher′s檢驗。MiR-133a在AMI和對照病例間表達(dá)的差異運用Mann-Whitney檢驗。AMI病例不同時間點間血漿miR表達(dá)差異的兩兩比較采用Wilcoxon檢驗。受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC） 用于分析 AMI病例與對照組間的差異。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的臨床特征 本研究中共納入67例AMI患者，另32名非AMI志愿者作為對照，臨床特征資料見表1。AMI病例平均年齡（63.84±11.17）歲，對照組平均年齡（61.75±9.58）歲，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.332）。研究組與對照組性別構(gòu)成均是男性居多（AMI組52名男性，對照組22名男性），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.343）。AMI組病例入院時平均 cTnT 水平為（1.30±1.06）ng/ml，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。研究組與對照組間各自臨床特征方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 循環(huán)miR-133a在AMI患者中的表達(dá)水平為了檢測循環(huán)miR-133a在AMI患者中的表達(dá)水平，我們分析了血漿miR-133a在AMI病例及對照組中的表達(dá)差異。如圖1所示，與對照組相比，AMI組病例血漿miR-133a明顯升高（P＜0.01）。

另外，我們也檢測了出院時AMI組病例與對照組外周血漿miR-133a表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)AMI組病例的miR-133a水平已回復(fù)到基線水平，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

2.3 循環(huán)miR-133a具備AMI早期診斷潛力我們應(yīng)用ROC曲線分析miR-133a是否具備早期診斷AMI的價值。如圖3所示，miR-133a的ROC曲 線 下 面 積 （areas under ROC curve，AUC）為0.9468 ［95% 可 信 區(qū) 間 （confidence interval，CI）0.9057～0.9879］；與之相應(yīng)，cTnT 的 AUC 為 0.9820（95%CI 0.9289～0.9975）。上述結(jié)果顯示，循環(huán) miR-133a對心肌梗死反應(yīng)的特異性和敏感性具備早期診斷AMI的潛力，但并不優(yōu)于cTnT。

3 討論

圖1 入院時血漿miR-133a在AMI組病例與對照組中的表達(dá)

圖2 出院時血漿miR-133a在AMI組病例與對照組中的表達(dá)

圖3 miR-133a與cTnT診斷AMI的特異度與敏感度的ROC綜合分析

表1 研究對象的臨床特征［±s，例數(shù)及百分率（%）］

表1 研究對象的臨床特征［±s，例數(shù)及百分率（%）］

cTnT（ng/ml）對照組 32 61.75±9.58 22/10 13（40.63） 5（15.63） 15（46.88） 14（43.75） 125.56±12.52 79.75±6.81 0.03±0.02 AMI組 67 63.84±11.17 52/15 32（47.76） 13（19.40） 38（56.72） 36（53.75） 129.66±15.35 81.57±9.76 1.30±1.06 P值 0.332 0.343 0.505 0.649 0.358 0.353 0.203 0.210 ＜0.01組別 例數(shù) 年齡（歲） 男/女 吸煙 糖尿病 高血壓 高脂血癥 收縮壓（mm Hg）舒張壓（mm Hg）

通過對入組的AMI患者采血進(jìn)行miR-133a含量變化的分析，我們發(fā)現(xiàn)，入院當(dāng)天、胸痛出現(xiàn)12 h內(nèi)miR-133a水平顯著升高，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；分析數(shù)據(jù)表明miR-133a表達(dá)量的變化與AMI的進(jìn)程相一致。研究報道，在AMI的早期階段，將很快出現(xiàn)心肌缺血、缺氧、水腫及壞死，壞死心肌釋放物如肌鈣蛋白（cTnT）、肌酸激酶（CK-MB）和腦利鈉肽（BNP）釋放入血循環(huán)中，這些生物標(biāo)志物已用于AMI的早期診斷。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，miR-133a在缺血再灌注的心肌細(xì)胞中表達(dá)降低，在經(jīng)過缺血預(yù)處理后表達(dá)增加，有助于減少因缺血再灌注損傷所致的心肌梗死面積，并能保護(hù)心肌細(xì)胞，減少心肌酶類的釋放；而且當(dāng)miR-133a的類似物轉(zhuǎn)染入心肌細(xì)胞后有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。我們認(rèn)為，在AMI的早期階段，miR-133a也可以從壞死心肌中釋放出來進(jìn)入血循環(huán)而標(biāo)志AMI的進(jìn)程。因此，我們選擇miR-133a進(jìn)行AMI早期診斷的研究[14]。

流行病學(xué)研究顯示,AMI是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率極高的疾病，每年發(fā)病率為300萬～400萬。再灌注療法的早期實施可顯著降低AMI的死亡率，因此，在AMI的早期階段進(jìn)行及時準(zhǔn)確的診斷尤為重要。根據(jù)ESC/ACC對心肌梗死的共識，診斷AMI時，cTnT比CK-MB、BNP或C-反應(yīng)蛋白具有對壞死心肌更高的敏感性和特異性[15，16]。然而，cTnT仍有不足之處。有報道指出，cTnT在終末期腎病中有明顯升高，可作為腎功能衰竭預(yù)后診斷的生物標(biāo)志物[4,17]。因此，有必要尋求對早期診斷AMI具有更高特異性及敏感性的生物標(biāo)志物。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRs在不同狀態(tài)下具有組織和細(xì)胞特異性，此外，miRs可被釋放到循環(huán)中并保持穩(wěn)定狀態(tài)[7]。一系列相關(guān)研究顯示，血循環(huán)中心肌特異性miRs的表達(dá)水平，伴隨心血管疾病的不同進(jìn)程而發(fā)生相應(yīng)改變，這意味著miRs有可能成為AMI診斷的新的生物標(biāo)志物[18]。

本研究的結(jié)果與近期的文獻(xiàn)報道是一致的，循環(huán)miR-133a在AMI階段升高，并明顯高于非AMI對照組循環(huán)血中miR-133a的表達(dá)水平；在AMI患者出院時，循環(huán)miR-133a又回落至正常水平。與此同時，我們也分析了AMI階段cTnT表達(dá)的變化。cTnT是目前臨床廣泛應(yīng)用的AMI診斷生物標(biāo)志物，能反映AMI梗死范圍的大小。與cTnI相比，cTnT對早期診斷AMI具有更高的敏感性和特異性[19]。

我們運用ROC曲線分析miR-133a與cTnT在早期診斷AMI中的價值。結(jié)果顯示，miR-133a在早期診斷AMI方面具有明確的心肌特異性和敏感性，具備作為AMI診斷生物標(biāo)志物的可行性。盡管結(jié)果也顯示miR-133a在AMI過程中的表達(dá)變化與cTnT有著良好的一致性，但ROC曲線分析并未發(fā)現(xiàn)miR-133a優(yōu)于cTnT。

根據(jù)上述結(jié)果分析，cTnT在AMI的早期診斷方面具有比miR-133a更高的敏感性和心肌特異性，因此我們推測，在AMI患者胸痛癥狀出現(xiàn)前就有cTnT從壞死心肌中釋放出來進(jìn)入循環(huán)。既往的研究已明確cTnT主要結(jié)合于心肌肌原纖維上，而miRNAs主要結(jié)合于細(xì)胞基質(zhì)蛋白復(fù)合體。我們認(rèn)為，也許正是這些差異導(dǎo)致了心肌壞死階段釋放cTnT和miRNAs的不同。有鑒于此，miRNA-133a與cTnT聯(lián)合檢測有助于對終末期腎病并發(fā)AMI的早期診斷。

通過此項研究我們認(rèn)為，miR-133a在AMI早期診斷中有一定價值，并與cTnT進(jìn)行了相應(yīng)比較。結(jié)果表明，miR-133a可作為早期診斷AMI的生物標(biāo)志物；然而其診斷AMI的特異性和敏感性并不優(yōu)于cTnT。由于cTnT在終末期腎病中也有明顯升高，我們認(rèn)為miR-133a與cTnT聯(lián)合早期診斷AMI具有更大的優(yōu)勢，可以提高敏感性和特異性，防止假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

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Comparing the early diagnostic values of plasma miR-133a and cardiac troponin T in patients with acute myocardial infarction

LI Ying-qing＊，LU Jian-hua，WANG Xi-fu，et al.＊Emergency Department of Guangzhou First People′s Hospital，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510180，China

LI Ying-qing，E-mail：hare0914@aliyun.com.LU Jian-hua，E-mail：doctorlujh@126.com

ObjectiveTo evaluate the expression of plasma cardiac-specific miR-133a in acute myocardial infarction（AMI）and compare their diagnostic values with that of cardiac troponin T（cTnT）.MethodsSixtyseven plasma samples obtained from patients with AMI and thirty-two plasma specimens collected from non-AMI volunteers were analyzed in this study.The level of cardiac-specific miR-133a was detected by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction（qRT-PCR），and the level of plasma cTnT was detected using electrochemiluminescence-based methods on the Elecsys 2010 Immunoassay Analyzer.ResultsThe level of plasma miR-133a was significantly increased in AMI patients（P＜0.01）compared with non-AMI volunteers.The expression of the cardiac-specific miR-133a in AMI patients decreased to close to the baseline at the time of hospital discharge（P＞0.05）.There was no correlation between the level of circulating miR-133a and the clinical characteristics of the study population（P＞0.05）.Furthermore，receiver operating characteristic（ROC）curve analyses showed that miR-133a was cardiac-specific and sensitive for the diagnosis of early AMI，but not superior to cTnT.ConclusionThe present study showed that the plasma miR-133a may be useful biomarker for AMI but is not superior to cTnT for the diagnosis of AMI.

MiR-133a； Cardiac troponin T； Acute myocardial infarction； Biomarker

國家自然科學(xué)基金（項目編號：81372023）

510180 廣東省，廣州市第一人民醫(yī)院急診科（李穎慶、盧建華、王西富）；中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科（李穎慶、李欣、胡春林、廖曉星）

李穎慶，E-mail：hare0914@aliyun.com；盧建華，E-mail：doctorlujh@126.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2014．01．002

R542.2+2

A

1672-5301(2014)01-0004－05

2013-11-04）