呂納強(qiáng) 黨愛(ài)民 鄭德裕 劉國(guó)仗

臨床研究

DQA1基因啟動(dòng)子區(qū)及編碼區(qū)與大動(dòng)脈炎的關(guān)聯(lián)研究

呂納強(qiáng) 黨愛(ài)民 鄭德裕 劉國(guó)仗

作者單位：100037 北京市，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院特需醫(yī)療中心

目的 大動(dòng)脈炎（Takayasu arteritis）是一種累及主動(dòng)脈及其主要分支的慢性進(jìn)行性非特異血管炎性疾病。本研究以人類白細(xì)胞抗原（HLA）-DQA1為候選基因分析其編碼區(qū)基因型和啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性與中國(guó)大動(dòng)脈炎的關(guān)聯(lián)。方法 采用病例對(duì)照研究的方法，入選中國(guó)漢族大動(dòng)脈炎患者100例和健康對(duì)照104例，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（PCR-SSP）和聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（PCR-SSCP）方法檢測(cè)HLA-DQA1基因編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)基因型，并分析基因型與疾病的關(guān)聯(lián)。結(jié)果 具有類似DQα鏈蛋白抗原結(jié)合槽部位肽結(jié)合袋的氨基酸組成結(jié)構(gòu)的DQA1*0301/2/3基因型，在大動(dòng)脈炎組顯著低于對(duì)照組（P=0.003）。DQA1啟動(dòng)子QAP 1.3在大動(dòng)脈炎組低于對(duì)照組（P=0.036）。結(jié)論 DQA1*0301/2/3基因型、DQA1啟動(dòng)子QAP 1.3基因型可能是大動(dòng)脈炎的保護(hù)基因型。

大動(dòng)脈炎； DQA1等位基因； HLA基因

大動(dòng)脈炎（Takayasu arteritis）是累及主動(dòng)脈及其主要分支的慢性進(jìn)行性非特性血管炎性疾病。炎癥損害中層動(dòng)脈壁，致大動(dòng)脈狹窄、擴(kuò)張或動(dòng)脈瘤形成[1-3]。大動(dòng)脈炎在我國(guó)并不罕見(jiàn)，1962年阜外醫(yī)院在國(guó)際上首先提出縮窄性大動(dòng)脈炎的概念，此后發(fā)現(xiàn)了大量的臨床病例[4,5]。大動(dòng)脈炎的病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為大動(dòng)脈炎發(fā)病與人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因密切相關(guān)[6]。

在大動(dòng)脈炎與HLA基因的關(guān)聯(lián)研究中，不同種族人群報(bào)道的易感基因型不同。日本的Dong等[7]對(duì)64例日本患者的研究發(fā)現(xiàn)，DQA1*0103在患者中頻率顯著升高，DQA1*0301在患者中頻率顯著低于正常對(duì)照。Khraishi等在北美的人群中未發(fā)現(xiàn)易感基因。Girona等在墨西哥患者中發(fā)現(xiàn)易感基因型是DRB1*1301。中國(guó)大動(dòng)脈炎患者與HLA-Ⅱ類基因相關(guān)性結(jié)果最早見(jiàn)于2000年黨愛(ài)民等[8]對(duì)84例患者的研究，發(fā)現(xiàn)DRB1*04、DRB1*07與大動(dòng)脈炎易感相關(guān)。此后肖占祥等對(duì)44例患者研究后發(fā)現(xiàn)DQA1*0301頻率顯著低于正常對(duì)照。從上述研究結(jié)果可知，對(duì)于HLA-Ⅱ類基因，在不同人群中的結(jié)論差異較大，可能與種族的差異有關(guān)，也可能部分研究例數(shù)較少，難以揭示易感基因型。此外，基因啟動(dòng)子的變異可能也參與疾病的發(fā)生、發(fā)展?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，同時(shí)為進(jìn)一步揭示大動(dòng)脈炎發(fā)病與HLA-DQA1類基因的關(guān)聯(lián)，本研究擴(kuò)大樣本量分析了中國(guó)漢族HLA-DQA1基因編碼區(qū)與大動(dòng)脈炎的關(guān)聯(lián)，并首次篩查了大動(dòng)脈炎患者DQA1啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性及與疾病的關(guān)聯(lián)，以期探索大動(dòng)脈炎的遺傳易感基因型。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究采用病例對(duì)照設(shè)計(jì)，入選漢族大動(dòng)脈炎患者100例，無(wú)血緣關(guān)系。大動(dòng)脈炎患者來(lái)自于阜外心血管病醫(yī)院。大動(dòng)脈炎診斷采用1990年美國(guó)風(fēng)濕協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。健康對(duì)照組入選104例。對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)高血壓、自身免疫性疾病、糖尿病、遺傳性結(jié)締組織疾病、自身免疫性疾病家族史的健康體檢者。入選者均簽署知情同意書(shū)。本研究得到阜外心血管病醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 HLA-DQA1基因編碼區(qū)PCR-SSP法分型 抽取入選患者及對(duì)照組人群靜脈血4 ml，用EDTANa2抗凝保存，采用飽和氯化鈉氯仿法提取外周血基因組DNA。根據(jù)Olerup等[9]設(shè)計(jì)11對(duì)SSP引物采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP） 進(jìn)行HLA-DQA1基因分型，根據(jù)HLA-DQA1基因外顯子3的217位SNP C/A設(shè)計(jì)PCR-SSP引物將DQA1*0301和DQA1*0302/3進(jìn)行區(qū)分。

1.3 HLA-DQA1基因啟動(dòng)子區(qū)PCR-SSCP法分型采用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）方法對(duì) HLA-DQA1基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行篩查及分型，純合子SSCP帶型為1條或2條，雜合子帶型為3條或4條。以純合子SSCP帶型為基礎(chǔ)與雜合子比對(duì)，測(cè)序驗(yàn)證。從NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站上的 dMHC 數(shù)據(jù)庫(kù)中查找不同HLA-DQ基因的等位基因序列及相對(duì)應(yīng)的特異性氨基酸序列。與文獻(xiàn)序列比對(duì)后，8種帶型的QAP等位基因根據(jù)相似的序列依次分別命名為 QAP4.1、QAP1.4、QAP2.1、QAP3.12、QAP4.2、QAP1.2、QAP1.3 和 QAP3.11。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0軟件包分析數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)用±s進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，2×2表卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率法分析組間等位基因頻率、基因型頻率和單倍型頻率，計(jì)算P值、OR值及95%CI。多元Logistic回歸分析調(diào)整混雜因素的影響。采用雙側(cè)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入選大動(dòng)脈炎患者臨床資料 入選大動(dòng)脈炎患者100例，其中男性26例，女性74例，男女比例為 1∶2.85，平均年齡（33.08±12.17）歲。對(duì)照組均為漢族，其中男性30名，女性74名，男女比例為1∶2.47，平均年齡（34.82±9.67）歲。入選大動(dòng)脈炎組患者與健康對(duì)照組兩組間性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 HLA-DQA1編碼區(qū)等位基因頻率分布分析在HLA-DQA1編碼區(qū)等位基因DQA1*0302/3的頻率大動(dòng)脈炎組顯著低于對(duì)照組（12.50%比20.19%，P=0.036，OR=0.565，95%CI 0.330～0.968），余等位基因大動(dòng)脈炎組與對(duì)照組未見(jiàn)明顯差異。見(jiàn)表1。

2.3 HLA-DQA1啟動(dòng)子區(qū)等位基因頻率分析 在HLA-DQA1啟動(dòng)子區(qū)，QAP1.3在大動(dòng)脈炎組顯著低于對(duì)照組 （5.00%比 10.58%，P=0.036，OR=0.445，95%CI 0.205～0.965），余等位基因大動(dòng)脈炎組與對(duì)照組未見(jiàn)明顯差異。見(jiàn)表2。

2.4 大動(dòng)脈炎患者發(fā)病與HLA-DQA1基因Logistic回歸分析 調(diào)整年齡、性別，對(duì)HLA-DQA1基因型與大動(dòng)脈炎發(fā)病進(jìn)行Logistic逐步回歸分析，結(jié)果顯示，具有類似DQα鏈蛋白抗原結(jié)合槽部位肽結(jié)合袋的氨基酸組成結(jié)構(gòu)的DQA1*0301/2/3基因型，大動(dòng)脈炎組顯著低于對(duì)照組（P=0.003）。

3 討論

大動(dòng)脈炎是累及大動(dòng)脈的炎癥性疾病，多見(jiàn)于主動(dòng)脈弓及其主要分支，亦可累及肺動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈，受累的血管表現(xiàn)為全層動(dòng)脈炎。其病因迄今尚不明確，一般認(rèn)為是自身免疫因素和遺傳背景共同參與導(dǎo)致的自身免疫性疾病[1-3,6，10]。

表1 HLA-DQA1編碼區(qū)等位基因頻率分布［例數(shù)及百分率（%）］

表2 HLA-DQA1啟動(dòng)子區(qū)等位基因頻率分布［例數(shù)及百分率（%）］

HLA-DQA1分子是由HLA-DQA1基因編碼的α鏈和β鏈互補(bǔ)形成的異二聚體，基因的多態(tài)性主要體現(xiàn)于胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域α1和β1形成的抗原結(jié)合槽部位。HLA-DQA1等位基因編碼的DQα鏈蛋白，它遞呈外來(lái)抗原給CD4+T細(xì)胞，不同等位基因編碼結(jié)構(gòu)不同，從而影響結(jié)合抗原肽的種類和親和力，使免疫應(yīng)答的效率不同。NCBI網(wǎng)站DQA1編碼區(qū)10個(gè)等位基因編碼的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，全長(zhǎng)246個(gè)氨基酸的DQα鏈蛋白中41個(gè)氨基酸存在顯著差異，HLA-DQA1基因外顯子多態(tài)性決定了抗原結(jié)合槽部位肽結(jié)合袋的多樣性。

在既往的研究中，Dong等[7]對(duì)64例日本患者的研究發(fā)現(xiàn)，DQA1*0103在患者中頻率顯著升高，DQA1*0301在患者中頻率顯著低于正常對(duì)照。國(guó)內(nèi)肖占祥等對(duì)44例漢族患者研究后也發(fā)現(xiàn)，DQA1*0301頻率顯著低于正常對(duì)照。本研究共入選了100例大動(dòng)脈炎患者，研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)與大動(dòng)脈炎發(fā)病關(guān)聯(lián)的HLA-DQA1易感基因；DQA1*0301等位基因型頻率在大動(dòng)脈炎組低于對(duì)照組（7.0%比10.1%），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而DQA1*0302/3在大動(dòng)脈炎組顯著低于對(duì)照組（12.50%比20.19%，P=0.036，OR=0.565，95%CI 0.330～0.968）。 通 過(guò) 對(duì)DQα鏈蛋白抗原結(jié)合槽部位肽結(jié)合袋的氨基酸組成分析，在HLA-DQA1最具多態(tài)性的第二外顯子的主要抗原結(jié)合槽，DQA1*0301與DQA1*0302/3具有相同的氨基酸組成，推測(cè)這一結(jié)構(gòu)可能減少大動(dòng)脈炎的發(fā)病。將DQA1*0301、DQA1*0302/3二者合并采用Logistic逐步回歸模型分析，大動(dòng)脈炎組頻率顯著低于對(duì)照組（P=0.003），Bonferroni校正后差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果進(jìn)一步支持了上述推測(cè)。

基因啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性影響表達(dá)效率。本研究首次篩查了大動(dòng)脈炎患者HLA-DQA1啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)了至少8種基因型，其中3型包含缺失的變異。體外研究[11]均表明，HLA-DQA1啟動(dòng)子多態(tài)性可影響其分子的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄活性QAP 3.11＞QAP 1.1＞QAP 4.2。此外，QAP2.1調(diào)控的分子表達(dá)水平也顯著高于QAP4。本研究未發(fā)現(xiàn)與大動(dòng)脈炎遺傳易感相關(guān)的多態(tài)性；HLA-DQA1啟動(dòng)子區(qū)QAP1.3在大動(dòng)脈炎組低于對(duì)照組（5.00%比10.58%，P=0.036，OR=0.445，95%CI 0.205～0.965），HLA基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性在大動(dòng)脈炎中的作用尚需進(jìn)一步研究探討。

本研究通過(guò)檢測(cè)中國(guó)漢族大動(dòng)脈炎患者HLADQA1基因編碼區(qū)及篩查DQA1啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性，初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)DQA1*0301/2/3基因型、DQA1啟動(dòng)子QAP 1.3基因型是大動(dòng)脈炎的保護(hù)基因型。未來(lái)更多的HLA基因與大動(dòng)脈炎的研究結(jié)果將有助于解釋HLA基因在大動(dòng)脈炎發(fā)病中的作用。

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The association of polymorphisms in the HLA-DQ gene with Takayasu arteritis

LYU Na-qiang，DANG Ai-min，ZHENG De-yu，et al.Special Medical Treatment Center，F(xiàn)uwai Hospital，Beijing 100037，China

Objective Takayasu arteritis（TA）is a chronic inflammatory arteritis affecting the aorta and its main branches.In this study a population based case-control study was used to analyze the association of polymorphisms in the HLA-DQA1 gene and DQA1 promoter（QAP）with the development of TA in Chinese Han population.Methods The study selected 100 TA patients and 104 healthy control subjects.Genotyping of polymorphisms in the coding region of HLA-DQA1 gene were performed with polymerase chain reaction-sequence specific primer（PCR-SSP）.Polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism（PCR-SSCP） was used to screen the mutations in the promoter region of HLA-DQA1 gene.Results The frequency of DQA1*0301/2/3 allele in TA patients was significantly lower than that in control subjects（P=0.003）.The frequency of QAP 1.3 in TA patients was significantly lower than that in control subjects（P=0.036）.Conclusion The alleles of DQA1*0301/2/3，QAP1.3 are the resistant factors to TA.

Takayasu arteritis； DQA1 allele； HLA gene

DANG Ai-min，E-mail：gemmadang@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：30370568）

黨愛(ài)民，E-mail：gemmadang@163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.08.001

R543.1

A

1672-5301（2014）08-0673－04

2014-06-22）