吳麗賢， 黃立森， 陳顯凌， 柯 方， 鄭 鳴， 許建華

新生霉素(Nov)是香豆素類抗生素的代表藥物，對DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ有很好的抑制作用[1]，在體內(nèi)外能夠抑制多種癌細胞的增殖，但由于其活性較低，一般用于抗癌藥聯(lián)合應(yīng)用及逆轉(zhuǎn)抗癌藥的耐藥性[2]。前期對Nov的抗腫瘤機制的研究還表明，Nov是熱休克蛋白90(HSP90)的C端抑制劑，能夠抑制HSP90的分子伴侶功能，影響客戶蛋白的正確結(jié)構(gòu)和功能，間接發(fā)揮抗腫瘤作用，但其抗癌活性很低，對白血病K562細胞的IC50高達500 μmol/L[3-4]。

損傷DNA是當(dāng)前臨床治療腫瘤常用的放射治療及絕大多數(shù)細胞毒類抗癌藥物共同的分子機制。在DNA損傷中，雙鏈斷裂對腫瘤細胞是最致命的打擊，主要檢測性標(biāo)志是γ-H2AX；它的修復(fù)主要通過兩種機制實現(xiàn)：一種是同源重組(HR)，另一種是非同源末端連接(NHEJ)，斷裂的DNA末端重新連接，可以在沒有模板的情況下進行DNA修復(fù)，但也更容易發(fā)生錯誤。DNA修復(fù)能力異常激活和增強是導(dǎo)致腫瘤對DNA損傷劑耐藥的重要分子基礎(chǔ)；相反，修復(fù)缺陷則使腫瘤對其高敏感。目前已有十余種靶向不同DNA修復(fù)分子的化合物正在進行不同階段的臨床試驗。

本課題組以Nov為母體化合物進行改造，獲得一系列衍生物，通過體外抗腫瘤活性的篩選，獲取了抗腫瘤活性較強的化合物FM-Nov17。本研究試圖探討FM-Nov17在體外抗K562及K562/G01細胞增殖的作用與其誘導(dǎo)DNA損傷的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 K562和K562/G01細胞(由福建醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)藥工程中心庫存保種)；化合物FM-Nov17由本課題組合成，純度96%以上；羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)、RNA酶和碘化丙啶(PI)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone公司)；γ-H2AX，p-ATM，p-Chk1，p-Chk2，Parp，p-P53，CDC25A，CDC25C，cleaved Caspase3單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；β-actin單克隆抗體和羊抗鼠、羊抗兔IgG-HRP二抗(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；ECL超強發(fā)光底物(美國Signalway antibody公司)；BCA蛋白定量試劑盒與流式凋亡檢測試劑盒(瑞士Roch公司)；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(南京凱基公司)；成像系統(tǒng)(Image station 4000MM，日本柯達公司)；流式細胞儀(FACSCanto Ⅱ，美國BD公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) K562細胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640、青霉素(100 IU/mL)和鏈霉素(50 μg/mL)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵育箱中培養(yǎng)；K562/G01細胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640、青霉素(100 IU/mL)和鏈霉素(50 μg/mL)，于4 μmol/L IM維持培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2MTT試驗 96孔培養(yǎng)板上每孔種植10 000個細胞，體積為200 μL，實驗組分別加入不同濃度的FM-Nov17和Nov，對照組不加藥。另設(shè)空白組(只加培養(yǎng)基，無細胞)，每組設(shè)3個副孔，37 ℃培養(yǎng)48 h，每孔加入5 μg/mL的MTT溶液20 μL[4]，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 000 r/min離心5 min棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用全自動酶標(biāo)儀檢測570 nm處的吸光度(OD)值，結(jié)果采用GraphPad Prism 5 軟件分析，并繪制相應(yīng)的存活率-對數(shù)濃度曲線，計算藥物的半數(shù)抑制率(IC50)。

1.2.3細胞增殖代數(shù)檢測 取對數(shù)生長期的K562及K562/G01細胞，用5 μmol/L CFSE 37 ℃預(yù)先處理10 min[5]，用4 ℃的含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液終止反應(yīng)并洗滌細胞2次，按實驗設(shè)計分組并加入不同濃度的FM-Nov17處理72 h。收集細胞，PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測，結(jié)果采用Modfit軟件分析。

1.2.4DNA損傷檢測 取對數(shù)生長期K562及K562/G01細胞，10 μmol/L的Brdu預(yù)處理30 min，不同濃度的FM-Nov17處理細胞24 h，收集細胞，以800 r/min離心5 min，棄上清，破膜，DNase處理1 h，anti-BrdU，anti-γ-H2AX，anti-cleaved Parp熒光探針室溫孵育20 min，按試劑盒說明操作，流式細胞儀檢測。

1.2.5細胞線粒體膜電位檢測 取對數(shù)生長期的K562和K562/G01細胞，分組并加入不同濃度的FM-Nov17處理4 h；收集細胞，1 000 r/min離心5 min；用冷PBS重懸洗滌細胞2次；按JC-1試劑盒的說明配置JC-1染料，37 ℃避光孵育20 min染色；1 000 r/min離心收集細胞，PBS重新懸浮細胞，流式細胞儀檢測線粒體膜電位的改變[6]。

1.2.6細胞周期進程檢測 取對數(shù)生長期的K562及K562/G01細胞，不同濃度的FM-Nov17處理48 h；1 000 r/min，5 min收集并洗滌細胞離心；75%冰冷的乙醇-20 ℃固定24 h；1 000 r/min離心5 min，棄去乙醇；含50 μg/mL RNA酶和50 μg/mL PI的PBS重懸細胞，室溫避光孵育30 min，流式細胞儀檢測；結(jié)果采用Modifit軟件分析。

1.2.7細胞凋亡率檢測 取對數(shù)生長期的K562和K562/G01細胞，不同濃度的FM-Nov17處理48 h，1 000 r/min離心5 min收集和洗滌細胞2次，用分別含有5 μL Annxin V-FITC和5 μL PI 的Binding Buffer避光孵育15 min，流式細胞儀檢測。

1.2.8蛋白免疫印跡 取對數(shù)生長期的K562和K562/G01細胞，不同濃度的FM-Nov17處理48 h，裂解細胞提取總蛋白，BCA蛋白定量，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉，相應(yīng)一抗過夜孵育，TBST洗滌3次，每次10 min，二抗室溫下孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，用ECL超強發(fā)光底物在成像系統(tǒng)進行曝光顯影。

2 結(jié) 果

2.1FM-Nov17體外抑制K562和K562/G01細胞增殖和減少增殖分裂代數(shù) MTT實驗結(jié)果表明,FM-Nov17和Nov都能夠明顯抑制細胞的增殖，F(xiàn)M-Nov17對K562和K562/G01細胞IC50分別為(58.28±0.31)和(62.36±0.14)μmol/L，而Nov對K562和K562/G01細胞IC50分別為(445.60±0.17)和(501.21±0.22)μmol/L(圖1)。

A:FM-Nov17； B：Nov.

不同濃度的FM-Nov17處理K562和K562/G01細胞72 h后， K562和K562/G01細胞的增殖分裂代數(shù)減少(圖2)。

2.2FM-Nov17誘導(dǎo)DNA的損傷 FM-Nov17處理細胞后， γ-H2AX發(fā)生磷酸化并聚集在DNA損傷處，流式細胞術(shù)檢測γ-H2AX百分比增加,并且呈劑量依賴關(guān)系。與此同時,凋亡標(biāo)志Cleaved-Parp的百分比也提高(圖3)。

A:K562細胞；B：K562/G01細胞. a、b分別為FM-Nov17 75,37.5 μmol/L, c:對照組.

A：流式細胞術(shù)檢測FM-Nov17誘導(dǎo)K562和K562/G01細胞DNA的損傷；B：FM-Nov17影響K562和K562/G01細胞內(nèi)γ-H2AX表達；C：FM-Nov17誘導(dǎo)K562和K562/G01細胞內(nèi)Parp的切割. 1.對照組； 2.FM-Nov17 37.5 μmol/L; 3.FM-Nov17 75 μmol/L. 與對照組比較，☆：P≤0.05；☆☆：P≤0.01；☆☆☆：P≤0.001.

2.3FM-Nov17影響K562和K562/G01細胞線粒體的膜電位 隨著FM-Nov17藥物濃度的增加，JC-1 Red/Green的比值減小，表明FM-Nov17能夠誘導(dǎo)線粒體膜電位的降低(圖4)。

2.4FM-Nov17誘導(dǎo)K562和K562/G01細胞凋亡 不同濃度的FM-Nov17處理K562和K562/G01細胞48 h，PI和Annexin V-FITC雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果表明，隨著FM-Nov17藥物濃度的增加，K562和K562/G01細胞的凋亡率隨之增加(圖5)。

2.5FM-Nov17誘導(dǎo)K562和K562/G01細胞周期G2/M期阻滯 不同濃度的FM-Nov17處理K562和K562/G01細胞48 h，PI染色流式細胞術(shù)檢測細胞周期，結(jié)果表明，隨著FM-Nov17藥物濃度的增加G2/M期K562和K562/G01細胞比例明顯增加(圖6)。

A：流式細胞術(shù)檢測FM-Nov17對線粒體膜電位的影響；B：柱狀圖描述FM-Nov17對線粒體膜電位的影響. 1. 對照組；2. FM-Nov17 37.5 μmol/L；3. FM-Nov17 75 μmol/L. 與對照組比較，☆☆☆：P≤0.0001.

A:流式細胞術(shù)檢測FM-Nov17增加K562和K562/G01細胞凋亡；B：柱狀圖定量描述FM-Nov17對細胞凋亡率影響. 1.對照組； 2.FM-Nov17 37.5 μmol/L; 3.FM-Nov17 75 μmol/L. 與對照組比較，☆☆☆：P≤0.001.

2.6FM-Nov17影響K562及K562/G01細胞蛋白表達 不同濃度的FM-Nov17處理K562和K562/G01細胞48 h，蛋白免疫印跡結(jié)果表明,Nov能顯著增加γ-H2AX、ATM、p-P53的表達以及Parp和Caspase 3的切割，而降低CDC25A和CDC25C的表達(圖7)。

3 討 論

CML是一種骨髓造血干細胞異?？寺⌒约膊7]，以BCR-ABL嵌合染色體為主要特征，BCR-ABL的基因產(chǎn)物為具有酪氨酸激酶活性的P210蛋白。IM是以P210為治療靶點的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)[8]，是治療CML的一線藥物，能明顯緩解CML的臨床癥狀，甚至在血液學(xué)和遺傳學(xué)方面達到完全緩解CML[9]。但IM對于CML急性期和急變期以及BCR-ABL突變的CML患者療效差，并且隨著IM的臨床使用，耐IM的病例不斷增加。解決以上問題的方法大體有兩種：其一，開發(fā)新的活性更高的TKI；其二，研發(fā)新的、非靶向BCR-ABL的抗腫瘤化合物。

臨床現(xiàn)今常用的放療和化療方法，大多數(shù)以誘導(dǎo)腫瘤細胞DNA損傷為機制，細胞遭受DNA損傷時，會激活DNA損傷反應(yīng)[10]，針對不同的損傷形式，激活不同的修復(fù)通路，如細胞受到輕微的DNA單個堿基的損傷便會激活堿基切除修復(fù)，當(dāng)細胞遭受嚴(yán)重DNA雙鏈斷裂損傷(DSB)時便激活同源重組(HR)修復(fù)或非同源末端鏈接(NHEJ)修復(fù)[11]。在細胞出現(xiàn)DSB時，組蛋白γ-H2AX磷酸化聚集到DSB斷裂處，招募其他DNA損傷修復(fù)蛋白如ATM、Chk1和Chk2等，ATM磷酸化而活化激活下游信號通路，如磷酸化P53能使抑制P53泛素化降解增強P53蛋白的功能[12]，磷酸化的Chk1和Chk2通過磷酸化P53穩(wěn)定和增強P53的功能[13]，影響細胞的正常代謝活動甚至激活細胞程序性死亡(細胞凋亡)。P53通過抑制下游的CDC25A和CDC25C的表達，抑制有絲分裂促進因子(MPF)復(fù)合物的形成[14]，使細胞不能順利通過G2/M期，誘導(dǎo)細胞周期G2/M期阻滯。P53也可以通過激活Bax介導(dǎo)的線粒體膜電位的降低，使細胞內(nèi)的細胞色素C釋放，激活Caspase信號通路，促使Parp和Caspase 3切割，使Parp修復(fù)功能喪失抑制DNA損傷修復(fù)以及激活線粒體凋亡通路，誘導(dǎo)細胞凋亡[15]。

圖6 FM-Nov17影響K562和K562/G01細胞周期進程

圖7 FM-Nov17影響K562和K562/G01細胞內(nèi)DNA損傷相關(guān)蛋白的表達

Nov具有抑制CML細胞的增殖作用，但活性偏低，F(xiàn)M-Nov17是Nov的衍生物，由本課題組合成，通過體外抗腫瘤活性篩選即MTT實驗表明，F(xiàn)M-Nov17也具有明顯的抗CML的增殖作用，其活性比Nov提高了4倍左右。CFSE是一種低毒并能穿透細胞膜的熒光染料，在細胞分裂增殖過程中，標(biāo)記熒光可平均分配至子代細胞中，熒光強度隨細胞的分裂而降低，可用于檢測細胞增殖，細胞周期的估算及細胞分裂等情況。CFSE實驗表明，F(xiàn)M-Nov17能夠減少CML細胞的增殖代數(shù)。進一步研究表明，F(xiàn)M-Nov17能夠誘導(dǎo)CML細胞DNA損傷激活DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)，增加p53的磷酸化，激活p53介導(dǎo)的細胞周期G2/M期阻滯和細胞凋亡，從而抑制CML的增殖。

綜上所述，新生霉素衍生物FM-Nov17體外具有明顯的抗CML活性，其機制為誘導(dǎo)DNA損傷觸發(fā)細胞周期阻滯和細胞凋亡。

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