鄧必權(quán)，侯鐵勝，傅強，胡華，熊軍

（1.武漢市中心醫(yī)院脊柱外科，湖北武漢430014；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院骨科，上海200433）

漢防己甲素對脊柱損傷模型大鼠m iRNA-24和Bim蛋白表達(dá)的影響

鄧必權(quán)1，侯鐵勝2，傅強2，胡華1，熊軍1

（1.武漢市中心醫(yī)院脊柱外科，湖北武漢430014；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院骨科，上海200433）

目的探究漢防己甲素對脊柱損傷模型大鼠miRNA-24和Bim蛋白表達(dá)的影響。方法114只Wistar大鼠，隨機分為3組，其中正常組35只，模型組36只，干預(yù)組43只。采用加速壓迫型Allen's打擊法對模型組及干預(yù)組大鼠造成脊柱損傷模型。3組大鼠在相同環(huán)境下飼養(yǎng)，造模成功后給予干預(yù)組大鼠靜滴漢防己甲素20mg／（kg·d），2周為1個療程；正常組和模型組給予等體積生理鹽水。給藥結(jié)束后，比較3組大鼠miRNA-24和Bim蛋白表達(dá)水平。結(jié)果治療后1、5、10 d，與正常組比較，模型組及干預(yù)組大鼠體內(nèi)miRNA-24表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，干預(yù)組大鼠體內(nèi)miRNA-24表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療后1、5、10 d，與正常組比較，模型組及干預(yù)組大鼠Bim蛋白表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，干預(yù)組大鼠Bim蛋白表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論漢防己甲素可有效降低脊柱損傷模型大鼠miRNA-24的表達(dá)，提高Bim蛋白表達(dá)，是治療脊柱損傷大鼠的有效藥物。

漢防己甲素；脊柱損傷；大鼠模型；miRNA-24；Bim蛋白

脊柱損傷常由高處墜落、交通及建筑事故、自然災(zāi)害等外傷因素所致，嚴(yán)重時可引起脊髓損傷［1］。傷后患者表現(xiàn)為頸部或腰背部疼痛、脊柱活動受限、四肢感覺及運動障礙，重則呼吸困難、大小便失禁，嚴(yán)重影響患者的正常生活，甚至危及患者生命［2］。脊柱損傷容易發(fā)生二次損傷，如血管損傷、胸腔積液、肺損傷、脊髓神經(jīng)損傷等。有數(shù)據(jù)顯示［3］，脊柱損傷最為嚴(yán)重的并發(fā)癥為脊髓損傷，在發(fā)達(dá)國家，脊髓損傷每年的發(fā)生率大約為13.3～45.9人／百萬人，且呈逐年升高趨勢。為了提高脊髓損傷患者的治療效果，減少脊髓損傷等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生，國內(nèi)外許多專家學(xué)者進(jìn)行了大量研究。有研究顯示［4］，miRNA-24是廣泛存在于人體內(nèi)的RNA，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，其含量的升高，說明細(xì)胞凋亡速度降低、消亡率下降，提示損傷組織不斷愈合［5］；Bim蛋白是Bcl-2蛋白家族的成員，是一種促凋亡蛋白，主要作用是促使細(xì)胞凋亡，其含量的降低說明體內(nèi)細(xì)胞凋亡減少，受損組織得到重建［6］。漢防己甲素，是一種抑制關(guān)節(jié)痛、風(fēng)濕病、神經(jīng)痛等疾病的有效藥物，具有抗腫瘤及抗敏作用［7］，目前作為治療脊柱損傷的藥物，被各大醫(yī)院所關(guān)注。為明確漢防己甲素治療脊柱損傷的機制，本文對漢防己甲素對脊柱損傷模型大鼠miRNA-24和Bim蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行了研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 114只健康成年SPF級雌性Wistar大鼠（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號0123008），體質(zhì)量219～253 g。

1.2 主要試劑 漢防己甲素注射劑（海南制藥廠有限公司制藥二廠，國藥準(zhǔn)字H20066570）；miRNA-24 RT-PCR引物（上海生工生物工程有限公司）；PCR反應(yīng)試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；Bim兔抗大鼠多克隆抗體（美國Abcam公司）。

1.3 方法

1.3.1 分組 將其分為3組，其中正常組35只，雄性12只，雌性23只，平均體質(zhì)量（120.2±5.8）g；模型組36只，雄性22只，雌性14只，平均體質(zhì)量（122.5±6.4）g；干預(yù)組43只，雄性28只，雌性15只，平均體質(zhì)量（119.9±4.8）g。本實驗遵循《實驗動物管理條例》［8］，符合3R原則。3組大鼠飼養(yǎng)方式一致，體質(zhì)量等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3.2 模型制備 大鼠在溫度、濕度等環(huán)境適宜的情況適應(yīng)性喂養(yǎng)飼養(yǎng)1周。待大鼠適應(yīng)環(huán)境后，參照《大鼠模型制備法》［9］，采用加速壓迫型Allen's打擊法對模型組及干預(yù)組大鼠進(jìn)行脊柱損傷造模。

1.3.3 給藥 3組小鼠在相同環(huán)境下飼養(yǎng)，干預(yù)組大鼠給予漢防己甲素注射劑，20mg／（kg·d），2周為1個療程。治療前后，分別采取大鼠空腹靜脈血3mL，3500 r／min離心10min，選取上層澄清血清，于－67℃保溫箱保存?zhèn)溆?。采用Rt-PCR檢測大鼠miRNA-24；采用Western blot檢測Bim蛋白的表達(dá)。Ct值與miRNA-24表達(dá)呈正相關(guān)，Bim的平均灰度值與其表達(dá)呈正相關(guān)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“±s”表示，正態(tài)資料組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療后3組大鼠不同時段體內(nèi)miRNA-24的Ct值比較 治療后1、5、10 d，與正常組比較，模型組及干預(yù)組大鼠體內(nèi)miRNA-24的Ct值顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，干預(yù)組大鼠體內(nèi)miRNA-24的Ct值顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

表1 治療后3組大鼠不同時段體內(nèi)miRNA-24的Ct值比較Tab.1 Comparison ofmiRNA-24 Ct value at different time after treatment in three groups

2.2 治療后3組大鼠不同時段Bim平均灰度值比較 治療后1、5、10 d，與正常組比較，模型組及干預(yù)組大鼠Bim平均灰度值顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，干預(yù)組大鼠 Bim平均灰度值顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2，圖1）。

圖1 3組大鼠Bim蛋白表達(dá)比較1，2：模型組；3，4，5：干預(yù)組；6，7，8：正常組Fig.1 Comparison of Bim protein expression in three groups1，2：Model group；3，4，5：Intervention group；6，7，8：Normal group

3 討論

脊柱損傷多由交通事故、戰(zhàn)爭、自然災(zāi)害等導(dǎo)致，嚴(yán)重時可引起脊髓損傷。臨床表現(xiàn)為脊柱活動受限、疼痛，嚴(yán)重時可導(dǎo)致脊髓損壞，造成運動感覺障礙，甚至二便不能自理。本病常易發(fā)生二次損傷、引起脊髓炎癥等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，已成為當(dāng)今社會較為嚴(yán)重的一類外傷性質(zhì)的疾病，發(fā)病率極高。研究顯示［10-14］，miRNA-24是人體內(nèi)具有抑制細(xì)胞凋亡作用的一類RNA，其含量的降低，說明細(xì)胞凋亡加速，提示組織、神經(jīng)等損傷嚴(yán)重；Bim蛋白是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白，其表達(dá)升高表明細(xì)胞凋亡增加，組織損害嚴(yán)重。漢防己甲素，是治療風(fēng)濕病、神經(jīng)痛的有效藥物，具有一定的抗腫瘤及抗敏作用，其作為治療脊柱損傷的新興藥物，已得到研究人員的廣泛關(guān)注。為進(jìn)一步探究漢防己甲素對脊柱損傷患者的治療效果，本文采用Wistar大鼠構(gòu)建了脊柱損傷模型。

本實驗研究結(jié)果顯示：治療后1、5、10 d，與正常組比較，模型組及干預(yù)組大鼠體內(nèi)miRNA-24的Ct值顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，干預(yù)組大鼠體內(nèi)miRNA-24的Ct值顯著降低（P＜0.05），與孟步亮等［14］實驗結(jié)果一致。治療后1、5、10 d，與正常組比較，模型組及干預(yù)組大鼠Bim平均灰度值顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，干預(yù)組大鼠Bim平均灰度值顯著升高（P＜0.05），與王力等［15］實驗結(jié)果一致。漢防己甲素是中藥防己的有效成分，研究證明其具有抗炎、抗脂質(zhì)過氧化、防止細(xì)胞受損、改善微循環(huán)及Ca2＋拮抗作用，可通過增加Bcl-2表達(dá)、降低bax表達(dá)，抑制急性脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，有益于脊髓組織的保護(hù)，促進(jìn)運動功能的恢復(fù)，改善局部微環(huán)境［3］。

綜上所述，漢防己甲素有明顯抑制細(xì)胞凋亡的作用，可通過提高大鼠miRNA-24的含量，降低Bim蛋白表達(dá)來治療脊柱損傷大鼠。

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［3］羅春山.漢防己甲素對大鼠急性脊髓損傷后神經(jīng)保護(hù)作用的機制研究［D］.重慶醫(yī)科大學(xué)，2013.

［4］王冠.川芎嗪對大鼠急性脊髓損傷中miRNA--24和Bim蛋白表達(dá)的影響［D］.中南大學(xué)，2013.

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（編校：吳茜，劉路路）

Effect of tetrandrine on expression ofm iRNA-24 and Bim protein of spinal injury model rats

DENG Bi-quan1，HOU Tie-sheng2，F(xiàn)U Qiang2，HU Hua1，XIONG Jun1

（1.Deparment of Spine Surgery，Wuhan Central Hospital，Wuhan 430014，China；2.Department of Orthopedics，Changhai Hospital Affiliated to Second Military Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo investigate the effects of tetrandrine on expression of miRNA-24 and Bim protein of spinal injury model rats.Methods114Wistar ratswere selected and divided into three groups：35 rats in normal group，36 rats in model group，and 43 rats in intervention group.All rats were prepared for spinal cord injury models using accelerated oppressive Allen method except that in normal group.All ratswere fed in the same environment，rats in intervention group were given tetrandrine 20mg／（kg·d），twoweekswas one course of treatment.rats in other two group were given an equal volume of saline，After treatment，expression of miRNA-24 and Bim protein in three groups were compared respectively.ResultsCompared with normal group，the Ct values ofmiRNA-24 inmodel group and intervention group were significantly higher than normal group at 1，5 and 10 d after treatment，and the difference was statistically significant（P＜0.05）；compared with model group，Ct value of miRNA-24 in intervention group was significantly lower than model group at1，5，10 d after treatment（P＜0.05）.Compared with normal group，the average gray values of Bim protein in model group and intervention group were significantly lower than model group at 1，5 and 10 d after treatment（P＜0.05）；compared withmodel group，the average gray value of Bim protein in intervention group was significantly higher thanmodelgroup at1，5 and 10 d after treatment（P＜0.05）.Conclusion Tetrandrine can effectively decrease miRNA-24 expression，increase Bim protein expression in spinal injury model rats，and it is effective to cure spinal injury rats.

tetrandrine；spinal injury；ratmodel；miRNA-24；Bim protein

R681.5

A

1005－1678（2014）08－0032－03

國家自然科學(xué)基金（30070762，30872629）

鄧必權(quán)，男，博士，主治醫(yī)師，研究方向：脊柱外科疾病，E-mail：dbiquandr＠126.com。