賈峰，王彤

（1.淄博市第一醫(yī)院骨傷科，山東淄博255200；2.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京210029）

透骨消痛顆粒含藥血清誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化的實驗研究

賈峰1，王彤2

（1.淄博市第一醫(yī)院骨傷科，山東淄博255200；2.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京210029）

目的探討透骨消痛顆粒含藥血清誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞（bonemarrow stromal cells，BMSCs）向軟骨細胞分化的潛能。方法以臨床等效劑量0.145 g／（kg·d）、0.29g／（kg·d）、0.58 g／（kg·d）制備各濃度透骨消痛顆粒含藥血清，36只SD大鼠隨機均分為空白對照組，低劑量組、中劑量組和高劑量組，分別給予0.9%生理鹽水20mL，不同濃度透骨消痛顆粒含藥血清各20mL，連續(xù)灌胃3 d，采用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)BMSCs，顯微鏡下觀察軟骨細胞分化的形態(tài)變化并計數(shù)；RT-PCR檢測骨髓基質(zhì)干細胞中Sox9、CollagenⅡ、Runx2 mRNA表達。結(jié)果空白對照組細胞呈梭形，漩渦狀，單一生長；透骨消痛顆粒含藥血清各組BMSCs形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變，至接種7 d后，其細胞生長達到高峰；透骨消痛顆粒含藥血清可促進軟骨細胞數(shù)量，且具有明顯的劑量效應(yīng)；透骨消痛顆粒含藥血清可增加Sox9、CollagenⅡ和Runx2 mRNA表達水平。結(jié)論透骨消痛顆粒含藥血清可有效誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細胞分化。

透骨消痛顆粒含藥血清；骨髓間充質(zhì)干細胞；軟骨；分化潛能

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）是具有多向分化潛能的非造血系干細胞，其可通過有效的誘導(dǎo)途徑分化為軟骨表型細胞，并在關(guān)節(jié)軟骨缺損和畸形的臨床治療中發(fā)揮重要作用［1-2］。研究顯示，透骨消痛顆粒具有延緩軟骨退變的生物學(xué)效應(yīng)，并對早、中期膝骨性關(guān)節(jié)炎有較好的治療作用［3-4］。因此，是否可將透骨消痛顆粒作為誘導(dǎo)劑來促進BMSCs向軟骨細胞定向分化？本實驗旨在通過采用透骨消痛顆粒含藥血清為誘導(dǎo)劑，觀察其對BMSCs誘導(dǎo)向軟骨細胞分化的潛能，為進一步將BMSCs應(yīng)用于臨床軟骨缺損修復(fù)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑與儀器 透骨消痛顆粒（主要成分：巴戟天、川芎、白芍、腫節(jié)風）由福州屏山藥廠生產(chǎn)，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、PBS、胰蛋白酶為美國Hy-clone公司產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品，Sox9抗體、Collagen II、Collagen X和β-actin引物均由南京生興生物技術(shù)有限公司合成。

BIO-TEK ELX800型全自動酶標儀為美國BIO-Tek公司產(chǎn)品，日立HU-12A型透射電鏡為日本日立公司產(chǎn)品。

1.2 透骨消痛顆粒含藥血清制備及動物分組 雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量200～220 g，采用摸球法隨機均分為空白對照組，透骨消痛低劑量組、中劑量組和高劑量組。空白對照組給予0.9%生理鹽水20mL連續(xù)灌胃3 d，透骨消痛藥物組給予預(yù)先制備好的不同濃度的透骨消痛水提物20mL／次，2次／d，動物給藥劑量相當于臨床等效劑量，依據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”計算［5］，低劑量組、中劑量組和高劑量組分別給予0.145 g／（kg·d）、0.29 g／（kg·d）、0.58 g／（kg·d）的透骨消痛顆粒臨床等效劑量；連續(xù)灌胃3 d，第4天1次服用全天劑量，禁食12 h，末次給藥3 h后采用鹽酸氯胺酮麻醉后腹主動脈采血，3000 r／min離心15min，分離血清后于56℃水浴30 min，滅活，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 BMSCs體外培養(yǎng) 采用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞。SD大鼠10%水合氯醛麻醉致死，髂骨骨髓腔處抽取6～8mL骨髓，放入DMEM-LG培養(yǎng)液中制備細胞懸液。制備好的細胞懸液以1500 r／min離心8 min，PBS清洗后加入DMEM完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，維生素C 50mg／L和青鏈霉素各100 U／mL）重懸細胞，計數(shù)有核細胞，并以2×109個／L濃度接種于培養(yǎng)瓶，置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后首次更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，后間隔2～3 d更換培養(yǎng)液，至細胞融合達80%～90%時，以0.02% EDTA和0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.4 BMSCs誘導(dǎo)向軟骨細胞分化 取第2代BMSCs經(jīng)2.5 g／L胰蛋白酶消化，以6×106個／L濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔終體積為100μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h貼壁后分別加入20mL生理鹽水（空白對照組）和20mL不同劑量透骨消痛顆粒水提物（低劑量組、中劑量組和高劑量組），DMEM常規(guī)培養(yǎng)2周。倒置顯微鏡下觀察BMSCs誘導(dǎo)細胞向軟骨細胞分化的形態(tài)變化，隨機選取10個視野的軟骨細胞進行計數(shù)，取均值作為軟骨細胞數(shù)量；透射電子顯微鏡下觀察接軟骨細胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.5 RT-PCR檢測骨髓基質(zhì)干細胞中Sox9、CollagenⅡ、Runx2 mRNA表達 干預(yù)48 h后，Trizol試劑提取總RNA，測定OD260和OD280，計算RNA的純度和含量。M-MLV反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用RT-PCR擴增Sox9、collagenⅡ、collagenⅩ。南京生興生物技術(shù)有限公司合成引物，2－△△CT法分析結(jié)果。引物設(shè)計如下：Sox9上游引物：5′-AGCAAAGGAGATGAAATCTGTTCTG-3′，下游引物：5′-AGGTTAACTGCTGGTGTTCTGAGA-3′；collagenⅡ上游引物：5′-GGCAATAGCAGGTTCACGTACA-3′，下游引物：5′-CGATAACAGTCTTGCCCCACTT-3′；Runx2上游引物：5′-AGAAGGCACAGACAGAAGCTTGA-3′，下游引物：5′-AGGAATGCGCCCTAAATCACT-3′；內(nèi)參β-actin上游引物：5′-TGTGCCCATCTACGAGGGGTATGC-3′，下游引物：5′-GGTACATGGTGGTGCCGCCAGAACA-3′。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0進行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“±s”表示，采用單因素方差分析比較，采用LSD法進行組間兩兩比較；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透骨消痛顆粒含藥血清誘導(dǎo)后BMSCs細胞形態(tài)變化

倒置顯微鏡下觀察，空白對照組細胞呈梭形，漩渦狀，且隨接種時間其形態(tài)保持單一生長，未見細胞老化現(xiàn)象；透骨消痛顆粒含藥血清組（中劑量組）在接種3 d后，細胞貼壁呈簇狀聚集，BMSCs形態(tài)向三角形或多邊形轉(zhuǎn)變；接種7 d后，其細胞生長達到高峰。透射電子顯微鏡下觀察接種3 d后軟骨細胞的超微結(jié)構(gòu)，空白對照組細胞呈圓形，核不規(guī)則，核仁清晰，染色質(zhì)均勻；透骨消痛顆粒含藥血清組（中劑量組）細胞呈圓形，核呈分葉狀，核仁清晰，細胞處于分裂早期見圖1。

圖1 顯微鏡下BMSCs細胞形態(tài)（×100）N：細胞核，RER：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Fig.1 Morphology of bonemarrow stromal cells（×100）N：cell nucleus；RER：rough endoplasmic reticulum

2.2 透骨消痛顆粒含藥血清對BMSCs向軟骨細胞分化數(shù)量的影響 給予不同濃度的含藥血清誘導(dǎo)后，隨培養(yǎng)時間推移，各組軟骨細胞數(shù)量不斷增加，在培養(yǎng)7 d后，軟骨細胞數(shù)可達到平臺期，透骨消痛顆粒含藥血清表現(xiàn)出明顯的促進軟骨細胞數(shù)量的作用，其培養(yǎng)5，7，9 d的吸光度值顯著高于對照組（P＜0.05，見圖2），且隨著透骨消痛顆粒含藥血清濃度的增加，軟骨細胞數(shù)量增加。

圖2 透骨消痛顆粒含藥血清對軟骨細胞數(shù)量的影響*P＜0.05，與對照組相比；＃P＜0.05，與高劑量組相比Fig.2 Effect of Tougu Xiaotong granule drug-containing serum on the amount of chondrocytes*P＜0.05，compared with control group；＃P＜0.05，compared with high-dose group

2.3 透骨消痛顆粒含藥血清對BMSCs中Sox9、CollagenⅡ和Runx2 mRNA表達水平的影響 不同劑量透骨消痛顆粒含藥血清誘導(dǎo)14 d后，RT-PCR結(jié)果顯示：各透骨消痛顆粒含藥血清組BMSCs中Sox9、CollagenⅡ和Runx2 mRNA表達水平均顯著高于空白對照組（P＜0.05），且高、中劑量透骨消痛顆粒含藥血清組中Sox9 mRNA表達水平高于低劑量組，高劑量組collagenⅡ和Runx2 mRNA表達水平高于中、低劑量組（P＜0.05，見圖3）。

圖3 透骨消痛顆粒含藥血清對BMSCs中Sox9、CollagenⅡ、Runx2 mRNA表達的影響*P＜0.05，與對照組相比；＃P＜0.05，與高劑量組相比Fig.3 Effect of Tougu Xiaotong granule containing serum on Sox9，CollagenⅡand Runx2 mRNA expression of BMSCs*P＜0.05，compared with control group；＃P＜0.05，compared with high-dose group

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨疾患臨床常見，由于軟骨缺乏豐富的血液供應(yīng)，其自我修復(fù)能力極其有限甚至無內(nèi)在修復(fù)能力，因此軟骨缺損的治療成為臨床面臨的巨大挑戰(zhàn)。組織工程技術(shù)是關(guān)節(jié)軟骨疾患修復(fù)的重要方法，其中軟骨細胞和BMSCs是軟骨組織工程學(xué)常用的種子細胞，由于軟骨細胞在增殖過程中去分化現(xiàn)象明顯，因此軟骨細胞有限的增殖能力限制了其在構(gòu)建組織工程軟骨種子細胞中的應(yīng)用。BMSCs是存在于骨髓基質(zhì)中的具有多項分化潛能的非造血細胞群［6-7］，在其較長的分裂增殖期內(nèi)，BMSCs可通過不斷的自我更新，分化為骨、軟骨、肌腱等多種結(jié)締組織。但在骨關(guān)節(jié)疾患中，由于BMSCs的缺乏，其增殖分化潛能減弱，因此，嘗試在不同的誘導(dǎo)條件下，促進BMSCs向軟骨細胞分化對臨床有重要意義。

既往研究發(fā)現(xiàn)，透骨消痛顆?？赏ㄟ^抑制氧自由基、細胞因子等生物效應(yīng)來延緩軟骨細胞、軟骨基質(zhì)的退變，從而改善關(guān)節(jié)形態(tài)［8］。同時，多項研究已證實透骨消痛顆?？纱龠MBMSCs向軟骨細胞增殖分化［9-11］，但該類研究并未涉及到骨分化過程中調(diào)節(jié)因子的作用。本研究采用含透骨消痛顆粒成分的血清體外培養(yǎng)大鼠BMSCs，結(jié)果顯示，透骨消痛顆粒含藥血清可促進BMSCs分化成為軟骨細胞。由于Ⅱ型膠原蛋白（CollagenⅡ）是軟骨基質(zhì)的重要組成成份，也是表達軟骨細胞的特異性基因，其含量增多可提高軟骨的抗壓性和耐磨性，從而延緩軟骨組織的退變。因此，本實驗采用透骨消痛顆粒含藥血清和細胞體外共同培養(yǎng)的方法，通過RT-PCR方法觀察了透骨消痛顆粒含藥血清對BMSCs中CollagenⅡ的影響，從而反映軟骨細胞表型的分化狀態(tài)。結(jié)果顯示：透骨消痛顆粒含藥血清可有效促進CollagenⅡ mRNA的表達，說明BMSCS向軟骨細胞表形轉(zhuǎn)化過程受到透骨消痛顆粒含藥血清的調(diào)節(jié)。

前期研究顯示，透骨消痛顆?？赏ㄟ^有效調(diào)控軟骨細胞線粒體凋亡［12］，維持軟骨細胞、軟骨基質(zhì)及軟骨下骨3者降解和合成正常偶聯(lián)的平衡，并可上調(diào)細胞周期中的關(guān)鍵蛋白而加速骨髓基質(zhì)干細胞周期的進程［13］，從而促進其增殖。從分子機制看，在骨分化過程中，Sox9為成軟骨過程中必需的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其通常在肥大軟骨細胞中不表達，而主要集中表達于成軟骨祖細胞和軟骨細胞［14-15］，因此，缺少Sox9將引起基質(zhì)干細胞凝聚階段的軟骨細胞分化阻滯，同時會使軟骨細胞終末期的分化速度加快，導(dǎo)致其提前鈣化，同時，其還可促進Ⅱ型膠原基因的表達，促進CollagenⅡ的分泌。Runx2亦為成骨細胞的特異轉(zhuǎn)錄因子，其對多能干細胞向成骨細胞分化起關(guān)鍵作用，并可促進軟骨的血管化以及軟骨細胞的成熟［16］。本研究中，透骨消痛顆粒含藥血清可有效促進BMSCs中Sox9和Runx2轉(zhuǎn)錄水平的升高，提示透骨消痛顆粒含藥血清可通過升高Sox9和Runx2表達水平參與誘導(dǎo)分化軟骨細胞的信號通路過程，且在一定程度上抑制BMSCs向肥大的軟骨細胞分化，而表現(xiàn)為終末細胞表型。

綜上所述，透骨消痛顆粒含藥血清可有效促進BMSCs分化成為軟骨細胞，在此過程中，Sox9和Runx2轉(zhuǎn)錄因子參與了軟骨細胞分化和增殖過程。

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（編校：吳茜，劉路路）

Effect of Tougu Xiaotong granule drug-containing serum on the chondrogenic potential of bonemarrow stromal cells

JIA Feng1，WANG Tong2

（1.Department of Orthopedics，F(xiàn)irst Hospital of Zibo，Zibo 255200，China；2.Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo investigate the effect of Tougu Xiaotong granule drug-containing serum on the chondrogenic potential of bone marrow stromal cells（BMSC）.MethodsTougu Xiaoyong granule drug-containing serum were prepared by clinical equivalent dose of0.145 g／（kg·d），0.29 g／（kg·d）and 0.58 g／（kg·d）.36 SD rats were randomly divided into blank control group，low-dose group，middle-dose group and high-dose group equally.Four groups were respectively accepted 20mL 0.9%saline and different concentration of Tougu Xiaotong granule drug-containing serum 20mL，continuous lavage in 3 d.BMSCswere cultivated by whole bonemarrow culturemethod，andmorphological changes of cartilage cell differentiation were observed undermicroscopes；Sox9，CollagenⅡ，Runx2 mRNA expression were detected by RT-PCR.ResultsBMSCs in blank control group showed fusiform，swirl，single growth，and BMSCsmorphology in Tougu Xiaotong granule drug-containing serum group were changed and reached the cellgrowth peak after7 d of cultivation.Tougu Xiaotong granule drug-containing serum promoted the amountof chondrocytes，and had obvious dose-response effect. Tougu Xiaotong granule drug-containing serum increased Sox9，CollagenⅡand Runx2 mRNA expression level significantly.Conclusion Tougu Xiaotong granule drug-containing serum can effectively induce the differentiation from BMSCs to chondrocytes.

Tougu Xiaotong granule drug-containing serum；bonemarrow stromal cells；chondrocytes；differentiation potential

R285.5

A

1005－1678（2014）08－0026－04

國家自然科學(xué)基金（81171851）

賈峰，男，學(xué)士，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)骨傷，E-mail：qch1821460028＠163.com。