葉 洪 金建生 陳曉春 張 靜

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，福建 福州 350001)

與衰老相關(guān)的研究一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。腎臟衰老的主要組織學(xué)特征是腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增生、節(jié)段性腎小球硬化、腎小管萎縮及腎小管間質(zhì)纖維化等〔1〕。中藥人參在我國(guó)應(yīng)用已有幾千年的歷史，人參皂苷Rg1作為人參的主要活性成分之一，具有肯定的促智、抗衰老、抗氧化和提高免疫力等作用。研究表明，人參皂苷具有抗腎炎、保護(hù)腎功能的作用〔2〕。但該藥物對(duì)于腎臟衰老的機(jī)制研究較少。本研究通過建立大劑量D-半乳糖所致的小鼠亞急性衰老模型，觀察人參皂苷Rg1對(duì)減輕腎臟衰老的病理變化，并探討其對(duì)擬衰老小鼠腎組織纖連蛋白(FN)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)β1及β誘導(dǎo)蛋白IG-H3(βigh3)等水平表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)雄性昆明種小鼠78只，均為三月齡，體重30～40 g(購自上海斯萊克公司，合格證號(hào)SCXK 滬 2003-0003)。SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。隨機(jī)分成六組，每組13只：青年組不進(jìn)行任何處理，造模開始即留取腎組織；模型組以400 mg·kg-1·d-1的D-半乳糖(上海試劑二廠)進(jìn)行腹腔注射，而Rg1預(yù)防組1～3及科素亞對(duì)照組予以D-半乳糖注射的同時(shí)另分別給予5、10、20 mg·kg-1·d-1的Rg1(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室提供，純度>98%)腹腔注射，或10 mg·kg-1·d-1的科素亞(杭州默沙東制藥有限公司)灌胃。12 w后，10%水合氯醛0.1 ml/20 g腹腔注射麻醉小鼠后，腹正中切開，原位灌洗，剝離雙腎，取一側(cè)腎臟置于新鮮配制的4%多聚甲醛固定24 h(置于4℃冰箱)，用于制備石蠟切片；另一側(cè)腎臟分成數(shù)塊，部分置于4%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS(pH 7.0～7.6)固定2～4 h，20%蔗糖溶液4℃浸泡過夜后，進(jìn)行冰凍切片，進(jìn)行SA-β-gal的組織化學(xué)染色，其余置于干燥EP管中，液氮冷凍后-80℃凍存，用于超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)及Western印跡。

1.2藥品和試劑 SOD試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所。X-gal為Sigma公司產(chǎn)品。兔抗小鼠FN多克隆抗體購自LAB VISION公司，兔抗小鼠βigh3單克隆抗體購自R&D Systems公司。兔抗小鼠TGFβ1多克隆抗體購自abCAM公司。二抗為羊抗兔試劑，均購自相應(yīng)公司。

1.3SA-β-gal染色〔3〕SA-β-gal染色按常規(guī)方法操作，染色后的衰老細(xì)胞為靛藍(lán)色，顯微鏡下每張切片按順時(shí)針方向隨機(jī)選取20個(gè)視野(×100)，結(jié)果采用半定量評(píng)分：0分：無陽性染色出現(xiàn)；1分：偶見小管內(nèi)有微弱染色；2分：部分小管節(jié)段出現(xiàn)陽性染色；3分：大部分小管出現(xiàn)彌漫性陽性染色，計(jì)算每張切片得分的平均值。

1.4腎組織SOD活力測(cè)定 按SOD Assay Kit-WST試劑手冊(cè)進(jìn)行。

1.5過碘酸雪夫(PAS)染色和腎臟病理分析〔4〕PAS染色按常規(guī)方法操作，光鏡下每張切片按順時(shí)針方向隨機(jī)選取20個(gè)腎小管-間質(zhì)視野(400倍)，行小管-間質(zhì)損傷評(píng)分：0分：腎小管間質(zhì)無明顯病變；0.5分：小的局灶性的小管間質(zhì)損傷；1分：皮質(zhì)區(qū)<10%的小管間質(zhì)損傷；2分：皮質(zhì)區(qū)存在10%～25%的小管間質(zhì)損傷；3分：皮質(zhì)區(qū)存在25%～75%的小管間質(zhì)損傷；4分：皮質(zhì)區(qū)存在≥75%的小管間質(zhì)損傷，計(jì)算每張切片平均值。同時(shí)選取20個(gè)腎小球(400倍)，計(jì)算每個(gè)小球PAS染色陽性面積和腎小球總面積，求兩者的比值；20個(gè)小球此比值的均數(shù)即為每張切片的系膜增生指數(shù)(MMEI)。

1.6免疫組化方法檢測(cè)FN、TGFβ1及βigh3 2 μm石蠟組織切片黏附于多聚賴氨酸黏片劑處理后的載玻片上，經(jīng)60℃烤片，常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫室溫孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，F(xiàn)N、TGFβ1及βigh3 分別以0.01 M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)高壓抗原修復(fù)，分別滴加一抗(FN 1∶250、TGFβ1 1∶100、βigh3 1∶100)4℃孵育過夜后，以二抗(羊抗兔)37℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素染核，分化、返藍(lán)、脫水、透明、封片。每組染色均設(shè)以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。取染色后的切片，在高倍鏡(200～400倍) 下隨機(jī)選擇20個(gè)腎小球視野或20個(gè)腎小管-間質(zhì)視野，根據(jù)染色強(qiáng)度和面積，按下列方法進(jìn)行半定量評(píng)分，染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn): 基本不著色者0分，著色淡者(低倍鏡下可疑陽性，高倍鏡下明確陽性)1分，適中者(低倍鏡下明確陽性)2分，深者(低倍鏡下強(qiáng)陽性)3分；染色面積標(biāo)準(zhǔn)：0分：無染色或微弱染色，1分：染色面積<25%，2分：染色面積在25%～50%之間，3分：:染色面積在50%～75%之間，4分：染色面積> 75%。將染色強(qiáng)度與染色面積得分相乘，所得分?jǐn)?shù)為該例的陽性積分。每組陽性總積分除例數(shù)等于各組的平均陽性積分。

1.7Western印跡檢測(cè)TGFβ1及βigh3 取腎組織加裂解液后勻漿，離心，取上清，測(cè)蛋白濃度。加蛋白上樣液于10%+十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%無脂奶粉封閉，加一抗TGFβ1(1∶2 000)、βigh3(1∶2 000)孵育4℃過夜。含0.1%吐溫PBS洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG中孵育1 h，洗膜，以化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果。采用Alpha EmagerTM 2200凝膠成像及分析系統(tǒng)，于可見光下采集底片上的蛋白條帶圖像，通過與相應(yīng)β-actin條帶密度比較，計(jì)算各條帶密度相對(duì)值。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 青年組的小鼠毛色白，其富含光澤，行動(dòng)和反應(yīng)情況靈敏。實(shí)施造模的1個(gè)月之后，各組小鼠均出現(xiàn)程度各異的皮毛粗糙和發(fā)黃，且精神萎靡，相關(guān)行動(dòng)較為遲緩，且不喜活動(dòng)，以模型組情況最為顯著。而以Rg1實(shí)施預(yù)防的各組整體情況均優(yōu)于模型組，其中Rg1 劑量為20 mg·kg-1·d-1時(shí)最優(yōu)。

2.2衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色 各組SA-β-gal染色陽性的細(xì)胞均定位于腎小管，腎小球中鮮有表達(dá)。與青年組相比，模型組及各預(yù)防組染色陽性細(xì)胞均顯著增加(均P<0.01)。與模型組相比，Rg1 20 mg·kg-1·d-1組與科素壓組衰老細(xì)胞均顯著減少(均P<0.01)。見圖1，表1。

2.3腎組織SOD活力測(cè)定 與青年組相比，模型組及各預(yù)防組腎臟SOD活力均顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，各預(yù)防組SOD活力均有不同程度回升(均P<0.01)，以Rg1 20 mg·kg-1·d-1預(yù)防組效果最明顯。后者與Rg1 10 mg·kg-1·d-1組及科素亞組相比，有顯著性差異(P<0.01)。見表1。

表1 各組小鼠衰老相關(guān)性指標(biāo)的情況對(duì)比±s,n=13)

圖1 各組小鼠SA-β-gal染色(×100)

2.4PAS染色鏡下觀察 建模12 w，模型組可見腎小球肥大，系膜增生，節(jié)段性腎小球硬化，基底膜增厚以及局灶性小管間質(zhì)損傷，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小管擴(kuò)張、萎縮、壞死等。Rg1 20 mg·kg-1·d-1預(yù)防組與科素亞組能顯著減輕腎小管間質(zhì)病變及小球系膜增生(均P<0.01)。在改善腎小管間質(zhì)損傷方面，Rg1 20 mg·kg-1·d-1預(yù)防組與科素亞組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；在減輕小球系膜基質(zhì)增生程度上，Rg1 20 mg·kg-1·d-1預(yù)防組不如科素亞組(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 各組小鼠腎臟病理改變狀況±s，n=8)

2.5腎組織FN、TGFβ1以及βigh3的表達(dá) FN主要定位于腎小球系膜基質(zhì)，腎小管間質(zhì)亦有少量表達(dá)。TGFβ1、βigh3主要分布于腎小管上皮細(xì)胞和基底膜，而腎小球中僅有微量表達(dá)。模型組腎小球及腎小管陽性染色顯著增多。各預(yù)防組可見不同程度的表達(dá)降低。見圖3～圖5，表3。

2.6Western印跡法檢測(cè)腎皮質(zhì)TGFβ1、β igh3蛋白相對(duì)表達(dá)量 單次檢測(cè)后，青年組中TGFβ1、β igh3僅有微量表達(dá)，模型組TGFβ1、β igh3蛋白水平明顯升高?？扑貋喗M和Rg1干預(yù)組TGFβ1、β igh3蛋白水平顯著下降，見圖6。

表3 各組小鼠的腎組織FN和TGFβ1以及βigh3染色平均陽性積分比較±s,n=13)

圖2 各組小鼠腎臟PAS染色(×400)

圖3 各組大鼠腎臟FN表達(dá)及部位(×400)

圖4 各組大鼠腎臟TGFβ1表達(dá)及部位(×400)

圖5 各組大鼠腎臟βigh3表達(dá)及部位(×200)

A：青年組；B：模型組；C：Rg1 5mg/kg/d組；D：Rg1 10mg/kg/d組；E：Rg1 20mg/kg/d組 F：科素亞組

2.7相關(guān)性分析 腎小管上皮細(xì)胞TGFβ1陽性信號(hào)與SA-β-gal染色陽性信號(hào)呈顯著正相關(guān)(r=0.756，P<0.01)。βigh3與TGFβ1染色陽性積分呈顯著正相關(guān)(r=0.927，P<0.01)。

3 討 論

現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為，人參中富含多類化學(xué)成分，如皂苷和多肽以及有機(jī)酸和脂溶性成分等，尤以人參皂苷的作用顯著〔5〕。在多類實(shí)驗(yàn)型腎病模型中，均可表明人參皂苷具有較好的腎保護(hù)效果，其可不同程度上緩解膜性腎病模型中的腎小管間質(zhì)性損傷和細(xì)胞中線粒體腫脹，以及足突融合和基底膜增厚〔6〕。有學(xué)者在研究中還發(fā)現(xiàn)〔7〕，人參皂苷能夠啟動(dòng)機(jī)體近曲小管的上皮細(xì)胞有關(guān)DNA復(fù)制從而修復(fù)由慶大霉素導(dǎo)致的腎小管組織壞死而達(dá)到治療效果。

本研究結(jié)果提示人參皂苷Rg1可能通過抗氧化機(jī)制來發(fā)揮其對(duì)抗腎臟衰老的作用。究其原因，認(rèn)為這可能是因?yàn)镽g1抗氧化作用可能是腎臟保護(hù)相關(guān)作用的主要機(jī)制〔8〕。Rg1通過提升機(jī)體的抗氧化能力，同時(shí)可清除已形成的氧自由基，抑制有關(guān)細(xì)胞的凋亡，以及調(diào)控血管活性類物質(zhì)達(dá)到延緩衰老的目的〔9〕。應(yīng)用不同劑量人參皂苷Rg1可緩解腎小球FN的沉積，同時(shí)下調(diào)小鼠腎小管上皮細(xì)胞TGFβ1和βigh3等蛋白的表達(dá)，以20 mg Rg1預(yù)防組最為明顯。此外，20 mg Rg1預(yù)防組雖可顯著緩解對(duì)于腎小管間質(zhì)的損傷，但在減少腎小球系膜基質(zhì)的增生程度上，不如科素亞組。人參皂苷Rg1可能對(duì)于擬衰老過程腎臟損傷具有一定的保護(hù)作用。FN和TGFβ1以及βigh3水平下調(diào)亦有可能是人參皂苷Rg1減緩腎臟的衰老機(jī)制之一〔10〕。其中的TGFβ主要是一種對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化進(jìn)行調(diào)節(jié)的重要因子，其過度形成能導(dǎo)致不可逆的機(jī)體組織纖維化，其中以TGFβ1和組織纖維化擁有最為緊密的聯(lián)系〔11〕。有報(bào)道稱〔12〕，TGFβ1對(duì)于機(jī)體成纖維細(xì)胞以及單核細(xì)胞均有一定趨化作用，其在腎臟的衰老過程內(nèi)，通常隨著年齡增加而表達(dá)水平上升。TGFβ1通常定位在腎小管細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)，SA-β-gal染色呈陽性的細(xì)胞亦主要定位在腎小管，少見于腎小球，相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，SA-β-gal染色與TGFβ1表達(dá)呈明顯的正相關(guān)，這表明衰老小管細(xì)胞有可能為TGFβ1蛋白表達(dá)的一個(gè)主要來源。FN作為TGFβ1效應(yīng)分子，其在模型組的腎小球中沉積顯著增大，但其他各Rg1預(yù)防組均可減少FN表達(dá)，以Rg1 20 mg·kg-1·d-1的效果最佳，這可能是因?yàn)镽g1通過下調(diào)機(jī)體TGFβ1表達(dá)水平來糾正發(fā)生于細(xì)胞外基質(zhì)的非正常代謝，從而緩解腎臟纖維化程度〔13〕。近年來研究認(rèn)為βigh3為TGFβ1下游分子，能夠作為TGFβ1的一種活性指標(biāo)。Li等〔14〕報(bào)道，βigh3可參與到細(xì)胞間黏附和遷移及增殖分化和信息傳遞過程，在正常腎組織內(nèi)，其表達(dá)部位常局限在腎臟近端的腎小管基底膜，但在腎小球旁器血管成分細(xì)胞中亦有βigh3的表達(dá)，這亦提示βigh3可能在所介導(dǎo)的腎小球硬化及間質(zhì)纖維化等過程內(nèi)發(fā)揮出重要作用，符合本文的報(bào)道結(jié)果。

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