許雙塔 許建華 鄭正榮 趙清泉 姚方輝 賀雅莉

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科，福建 泉州 362000)

表皮生長因子受體(EGFR)是一類將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的重要途徑蛋白受體，具有酪氨酸激酶(TK)的活性。研究證實(shí)〔1〕，多數(shù)實(shí)體瘤，如鱗狀食管癌、鼻咽癌、非小細(xì)胞肺癌、喉癌等都存在EGFR蛋白過度表達(dá)?，F(xiàn)在研究的分子靶向藥尤其是抗腫瘤靶向藥物主要分為兩類〔2〕，OSI-774、IMC-C225均屬于EGRF-TK拮抗劑，在頭頸部腫瘤中顯示出良好的抑制作用〔3〕，但未見對食管癌的研究。本文通過建立鱗狀食管癌裸鼠荷瘤模型，研究EGFR抑制劑OSI-774、IMC-C225單藥以及聯(lián)合治療抗腫瘤的效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 雌性裸鼠40只，購自北京利華公司，10～12周齡，體質(zhì)量20～24 g；鱗狀食管癌細(xì)胞株(中科院上海生物研究所)；OSI-774(埃羅替尼，羅氏制藥)；IMC-C225(西妥昔單抗注射液，德國霍克大藥廠)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動物模型建立 將鱗狀食管癌細(xì)胞株懸浮于RPMI-1460(含10%FBS)培養(yǎng)液中，于5%CO2飽和，37℃下傳代培養(yǎng)，維持細(xì)胞單層生長；收集腫瘤細(xì)胞與RPMI制成1∶1的細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞密度為1×108個(gè)/ml。用1 ml注射液吸取0.2 ml腫瘤細(xì)胞注射在裸鼠皮下，觀察1 w，至腫瘤直徑>1 cm，進(jìn)行藥物治療。

1.2.2分組及給藥 將40只裸鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為4組，對照組：不進(jìn)行任何治療；OSI-774組予OSI-774 30 mg/kg，灌胃給藥， 1次/d；IMC-C225組予IMC-C225 50 mg/kg，靜脈給藥，1次/d；OSI-774聯(lián)合IMC-C225組(OSI-774、IMC-C225劑量、用藥方法同以上兩組)。治療過程中觀察裸鼠的體重及生存狀態(tài)。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1腫瘤體積變化 治療后第3天開始測量并記錄腫瘤體積，以卡尺測量腫瘤最大垂直徑(L)與最短直徑(D)，計(jì)算公式〔4〕：腫瘤體積(V)=(L+D2)/2 mm3，記錄腫瘤體積及生長時(shí)間，直至腫瘤體積達(dá)到3 cm3時(shí)，對比生長時(shí)間。

1.3.2免疫熒光染色法檢測腫瘤組織 治療1 w后，隨機(jī)選取4只裸鼠模型，切除完整腫瘤組織，5%甲醛固定，石蠟包埋，用熒光標(biāo)記的caspase、Ki67標(biāo)記，熒光顯微鏡下觀察caspase、Ki67的表達(dá)。

1.3.3細(xì)胞增殖測定 利用熒光染色檢測Ki67陽性腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)(1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞中Ki67陽性腫瘤細(xì)胞數(shù))，計(jì)算Ki67指數(shù)，從而檢測腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)。

1.3.4腫瘤細(xì)胞凋亡檢測 利用熒光染色的caspase檢測細(xì)胞凋亡情況，在熒光顯微鏡下選擇caspase陽性細(xì)胞分布較均勻的4個(gè)區(qū)域，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1腫瘤細(xì)胞生長時(shí)間評價(jià) 建立的鱗狀食管癌裸鼠荷瘤模型在1 w后均正常存活，可以觸及腫瘤硬塊，平均直徑>1 cm。治療后發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組達(dá)到30 m2的時(shí)間較其他組明顯延長。見表1，圖1。

2.2腫瘤細(xì)胞增殖評價(jià) 對照組Ki67指數(shù)最高，熒光染色顯示Ki67高表達(dá)，提示細(xì)胞增殖速度快，生長活躍；OSI-774組、IMC-C225組Ki67相對表達(dá)少，細(xì)胞增殖受到抑制；OSI774聯(lián)合IMC-C225組Ki67較前3組下降明顯，說明細(xì)胞增殖受到明顯抑制，見表1。

2.3腫瘤細(xì)胞凋亡評價(jià) OSI-774組(5.7±0.4)、IMC-C225組(5.8±0.1)較對照組(3.6±0.2)細(xì)胞凋亡明顯增加(P=0.022，0.002)，OSI-774聯(lián)合IMC-C225組(10.9±0.7)較前3組凋亡明顯(P=0.006，0.009，0.005)，提示聯(lián)合組可以起到協(xié)同治療的作用。

表1 4組試驗(yàn)中各項(xiàng)指標(biāo)對比±s,n=10)

圖1 4組治療后腫瘤體積隨時(shí)間的變化

3 討 論

EGFR基因位于人類7號染色體的短臂上，含有28個(gè)外顯子，長度為118 kb，有1 210個(gè)氨基酸編碼的糖蛋白(分子量為170 kD)〔5〕。目前發(fā)現(xiàn)EGFR突變與多種腫瘤發(fā)生有關(guān)，主要突變形式為基因點(diǎn)突變、基因擴(kuò)增、基因插入和基因缺失〔6〕。大量文獻(xiàn)提示〔7〕EGFR突變集中于18～22外顯子，主要位于EGFR-TK區(qū)，其中19外顯子多為缺失，占所有突變的47%；21外顯子多為基因替代，占所有突變的45%。因此普遍認(rèn)為這兩處突變可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對酪氨酸激酶抑制劑的敏感性，并且是EGFR抑制劑治療的有效預(yù)測指標(biāo)。Paez等〔8〕利用DHPLC檢測了100多種肺癌組織，發(fā)現(xiàn)了28例突變，其中包含19外顯子的缺失和21、22外顯子的替代。Mukasa等〔9〕檢測70例胰腺癌組織，發(fā)現(xiàn)只有2例有20外顯子突變，但是卻有29例基因擴(kuò)增，高達(dá)41.4%。Noh等〔10〕的一項(xiàng)報(bào)告中發(fā)現(xiàn)，在59例卵巢癌檢測18～22外顯子突變情況，發(fā)現(xiàn)3例突變，且均為19外顯子缺失。

抗腫瘤靶向藥物主要分為2類，一類為酪氨酸激酶的抑制劑，主要通過抑制EGRF-TK中酪氨酸激酶的活性來抑制腫瘤的生長；另一類是通過阻斷EGRF-配體復(fù)合物的形成阻斷信號傳遞，抑制腫瘤生長。其中，OSI-774、IMC-C225均屬于EGRF-TK拮抗劑。臨床上使用IMC-C225治療直腸癌取得了良好的效果〔11〕，證實(shí)了IMC-C225可以逆轉(zhuǎn)放化療的抗性，提高患者的生活質(zhì)量和生存期，且不良反應(yīng)較低。也有研究證實(shí)〔12〕OSI-774聯(lián)合化療可以提高頭頸部腫瘤患者的局部控制率，減少復(fù)發(fā)，延長生存期。綜合國內(nèi)外研究報(bào)道〔13〕，發(fā)現(xiàn)EGFR抑制劑在非小細(xì)胞肺癌、頭頸部鱗癌、結(jié)直腸癌治療上均取得了巨大的進(jìn)展，但是同樣的藥物和方法是否可以應(yīng)用于其他腫瘤治療尚需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究結(jié)果說明OSI-774和IMC-C225聯(lián)合可以增進(jìn)療效。為臨床藥物治療及分子靶向藥物研究提供一定參考。

4 參考文獻(xiàn)

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