付德才 吳杭源

(無錫市第五人民醫(yī)院，江蘇 無錫 214007)

肝纖維化是肝硬化的前期階段，肝星型細(xì)胞(HSC)活化是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)〔1,2〕。誘發(fā)HSC活化的因素很多，其中病毒、酒精、藥物、自身免疫是已知的主要因素。肝組織活檢是診斷肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)，肝組織病理學(xué)改善，證實(shí)抗纖維化治療有效，肝組織病理學(xué)改善是判斷抗纖維化治療療效的直接證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)觀察甲珠抗肝纖維化治療后肝組織病理改變，判斷甲珠抗肝纖維化治療療效。

1 材料和方法

1.1材料 雄性Wistar大鼠108只，鼠齡23個月，體質(zhì)量(180±30)g,甲珠研細(xì)末用前采用蒸餾水制成混懸液。高劑量組為2.0 g/kg(體質(zhì)量)，中劑量組為1.0 g/kg(體質(zhì)量)，低劑量組為0.5 g/kg(體質(zhì)量)。結(jié)合大鼠胃的承受量按2 ml/次，2次/d灌胃。

1.2方法

1.2.1模型制作 實(shí)驗(yàn)第1天除正?？瞻讓φ战M(簡稱對照組)外，其余動物予CCl4分析純5 ml/kg體質(zhì)量，以后每隔3 d注射400 ml/L CCl4橄欖油劑3 ml/kg體質(zhì)量，連續(xù)8 w。實(shí)驗(yàn)前2 w飼喂高脂玉米粉飼料(795 g/kg玉米粉+200 g/kg豬油+5 g/kg膽固醇)，第3～6周飼喂1 000 g/kg玉米粉和300 ml/L乙醇飲料。

1.2.2分組及給藥方法 采用成組設(shè)計(jì)，將108只大鼠隨機(jī)分為6組，每組18只，對照組，飼喂正常飲食；模型組，按上述造模方法給予飲食；秋水仙堿組，于造模第3周開始給予秋水仙堿0.1 mg·kg-1·d-1；甲珠高劑量治療組，于造模第3周開始予甲珠混懸液2.0 g·kg-1·d-1(體質(zhì)量);甲珠中劑量治療組，于造模第3周開始予甲珠混懸液1.0 g·kg-1·d-1(體質(zhì)量)；甲珠低劑量治療組，于造模第3周開始，給予甲珠混懸液0.5 g·kg-1·d-1(體質(zhì)量)，共8 w。造模結(jié)束時模型組死亡3只，中劑量組死亡3只，低劑量組死亡2只，秋水仙堿組死亡2只，高劑量組死亡1只，為增加可比性，每組均采用15只。

1.2.3標(biāo)本制作 上述造模及處理過程結(jié)束后，禁食12 h后稱質(zhì)量，心包取血，分離血清置-20℃保存；并立刻完整摘取肝臟及脾臟，肝右葉置于40 g/L中性甲醛液中常規(guī)固定后，石蠟包埋，用于制作組織芯片。

1.2.4檢測指標(biāo) 采用Masson三色染色法。染色結(jié)果：膠原纖維呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，胞質(zhì)呈深紅色；染色結(jié)果判定：Masson染色后在光鏡下觀察組織切片的病理變化并攝片。每張切片取四周及中央?yún)^(qū)域，選取膠原纖維含量最多的視野，每個視野含一個匯管區(qū)。采用HIAPS-2000型計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，通過顯微攝影系統(tǒng)攝取圖像并輸入圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度變換，使膠原纖維著色區(qū)域與背景分開，自動記錄著色面積和總面積。于200倍鏡下測定膠原纖維面積百分比，計(jì)算方法為：膠原纖維面積/肝組織面積×100%，取平均值。

2 結(jié) 果

正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列規(guī)則，小葉周邊僅見少量膠原纖維呈藍(lán)色，染色較輕。模型組大鼠肝組織膠原纖維明顯增生，沿匯管區(qū)或炎癥壞死區(qū)向外延伸，形成厚薄不一的纖維間隔，分割包繞肝小葉，局部有假小葉形成。甲珠干預(yù)各組肝組織也有少量的膠原纖維增生，主要分布于肝臟間質(zhì)內(nèi)，部分向肝小葉內(nèi)伸展，且膠原纖維較纖細(xì)，部分區(qū)域可見膠原纖維沿炎癥壞死區(qū)延伸，形成間斷、薄的纖維間隔，無明顯假小葉形成。秋水仙堿組介于治療組和模型組之間。見圖1。

圖1 小鼠肝組織Masson染色結(jié)果(×200)

Masson膠原染色定量分析結(jié)果表明，模型組膠原顯色指數(shù)(12.70±1.03)明顯高于正常對照組(0.35±0.036)(P<0.01)，甲珠高劑量組(6.34±0.66)、中劑量組(8.51±0.96)和秋水仙堿組(8.45±0.82)膠原顯色指數(shù)顯著低于模型組(P<0.01)，甲珠低劑量組膠原顯色指數(shù)(11.88±1.44)明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

肝纖維化是指各種致病因素引起肝臟損害和炎癥，在修復(fù)過程中導(dǎo)致肝臟細(xì)胞外基質(zhì)異常增多和過度沉積的病理過程。病情進(jìn)展可發(fā)展為肝硬化，甚至發(fā)生癌變。研究證實(shí)肝纖維化與臨床抗病毒療效呈負(fù)相關(guān)，與肝癌發(fā)生正相關(guān)。肝纖維化可能是由于長期的肝損傷啟動肝內(nèi)細(xì)胞凋亡而引起的：肝細(xì)胞凋亡后形成的凋亡小體和其他細(xì)胞碎片被HSC吞噬，引起HSC的活化、增殖、轉(zhuǎn)化成肌成纖維樣細(xì)胞，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的沉積形成纖維化〔3〕。Bcl-2家族通過激活一系列下游基因發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用〔4〕，Bcl-2、Bax的表達(dá)變化決定了肝細(xì)胞、HSC的凋亡，進(jìn)而影響纖維化的進(jìn)程〔5〕。正常細(xì)胞中Bax主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，受到損傷、刺激后，激活的Bax將重新定位于線粒體表面，直接或間接的在線粒體上形成孔道，引起細(xì)胞色素C的釋放，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔6〕。肝細(xì)胞凋亡是調(diào)節(jié)肝組織正常細(xì)胞更新、增殖以及再生的重要機(jī)制，有抗感染、腫瘤及防止 自身免疫反應(yīng)等作用，而肝細(xì)胞過度凋亡則會導(dǎo)致肝衰竭.同時肝細(xì)胞凋亡也是造成肝臟損傷和肝臟疾病的中心環(huán)節(jié)〔7〕。

研究發(fā)現(xiàn)慢性炎癥反應(yīng)過程可導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增加和降低胞內(nèi)抗氧化能力〔8〕,目前認(rèn)為肝細(xì)胞受損產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化作用為HSC的激活和纖維化的產(chǎn)生提供了基礎(chǔ)〔9〕，脂質(zhì)過氧化是肝纖維化發(fā)生途徑中的重要環(huán)節(jié)之一。HSC內(nèi)的活性氧(ROS)通過氧化敏感的蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控各種介質(zhì)的活化和表達(dá)，誘導(dǎo)肝纖維化〔10,11〕。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶NOX是細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要酶來源，在肝纖維化中起重要作用，也許因此成為治療肝纖維化的重要新型靶點(diǎn)〔12〕。

祖國醫(yī)學(xué)辯證認(rèn)為肝纖維化是由于氣滯、血瘀、絡(luò)阻所致，肝纖維化初期主要為氣滯，進(jìn)而血瘀，最后絡(luò)阻，氣機(jī)不暢，肝纖維化、肝硬化形成?？估w維化治療，可以減少肝硬化并發(fā)癥門脈高壓、腹水、消化道出血等的發(fā)生，中醫(yī)藥具有潛在的優(yōu)勢〔13〕。甲珠為穿山甲的鱗片，主歸肝經(jīng)，具有軟堅(jiān)、通絡(luò)、散結(jié)的功效，是歷代醫(yī)家治療癥、瘕、集、聚的常用藥，近來，被廣泛用治肝硬化取得了較好的臨床效果。 本實(shí)驗(yàn)證實(shí)甲珠對實(shí)驗(yàn)大鼠從HSC活化、細(xì)胞外基質(zhì)形成、細(xì)胞因子釋放、肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的發(fā)生等多方面干預(yù)肝纖維化的發(fā)生和抑制肝纖維化的進(jìn)展。

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