王宇峰 張立娜 王洪峰

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117)

重癥肌無力(MG)是一種以神經(jīng)肌肉接頭(NMJ)處傳遞功能障礙為主要病理改變的獲得性自身免疫性疾病，主要由于NMJ突觸后膜上乙酰膽堿受體(AchR)受損引起。其主要臨床表現(xiàn)為部分或全身骨骼肌無力和極易疲勞，活動后癥狀加重，經(jīng)休息和膽堿酯酶抑制劑(ChEI)治療后癥狀減輕〔1〕。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為MG屬于“痿證”的范疇，患者以脾氣虛弱、腎陽不足為主要病機(jī)，筆者以溫陽補(bǔ)氣為主要治療原則，采用針灸療法治療本病取得了良好的臨床療效。為進(jìn)一步研究“溫陽補(bǔ)氣”針法治療MG的作用機(jī)制，本研究采用國際公認(rèn)的免疫接種法建立實驗性自身免疫性MG(EAMG)大鼠動物模型，觀察該針法對EAMG大鼠NMJ處AchR表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF三級Lewis大鼠80只，雌性，6～8 w齡，平均體質(zhì)量(154±7.4)g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，合格證號碼：SCXK(滬)2007-0005，檢疫后送至長春中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，標(biāo)準(zhǔn)大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.2主要試劑和儀器 AchRα1 129-145多肽片段(美國Sigma公司)，大鼠AchR-Ab、AchR ELISA 檢測試劑盒(上海研輝生物科技有限公司)，溴吡斯的明(60 mg/片，上海三維制藥有限公司)，艾絨(南陽綠瑩艾草生物制品有限公司)。

1.3大鼠EAMG模型建立方法 選取SPF級Lewis大鼠70只，采用免疫接種法建立EAMG大鼠動物模型。將AchRα1 129～145多肽片段按照1∶2的比例與CFA完全乳化，配比按照200 μl溶液內(nèi)含有50 μg片段，不足部分用pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)定容至20 ml，充分混勻制成免疫乳劑，取一滴乳劑滴入水中呈現(xiàn)球形而不分散為乳化好的標(biāo)志。首次免疫接種時，將上述抗原乳劑以300 μl/只(含AchRα1 129～145∶75 μg)多點注射于大鼠四只足墊部、尾根部、背部。在首次免疫后第4和8周，分別進(jìn)行強(qiáng)化免疫接種，將AchRα1 129～145多肽片段以1∶2的比例與IFA完全乳化，配比按照200 μl溶液含有50 μg片段，不足部分用PH7.4的PBS液定容至20 ml，以200 μl/只(含AchRα1 129-145：50μg)多點注射于大鼠四只足墊部、尾根部、背部。以Lennon分級評分≥1分〔2〕，同時AchR-ab為陽性為EAMG大鼠模型造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.4分組及治療方法 選取建模成功的EAMG大鼠30只，隨機(jī)分為針灸治療組、藥物對照組和模型對照組，每組10只，選取同期購進(jìn)未建模的SPF級Lewis大鼠10只設(shè)為空白對照組。針灸治療組予以“溫陽補(bǔ)氣”針法治療，手三里(雙)直刺5 mm，足三里(雙)直刺6 mm，脾俞(雙)直刺6 mm，腎俞(雙)直刺6 mm，平補(bǔ)平瀉，針上加灸，30 min/次，1次/d，7 d為一療程，療程間休息1 d，連續(xù)治療2個療程。藥物對照組予以溴吡斯的明灌胃治療，18.5 mg/kg/d，連續(xù)治療15 d。模型對照組和空白對照組大鼠不予特殊處置，同等條件下飼養(yǎng)，每日抓取1次，觀察一般情況。

1.5檢測指標(biāo)及方法 大鼠NMJ處AchR表達(dá)水平的檢測：取大鼠下肢腓腸肌，立即用Warring 肌肉均漿器4℃攪拌制備勻漿，30 s/次，間隔15壁s攪拌1次，共攪拌3次；加入PBS不敷出10 ml，其中含0.4 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、0.4 mmol/L疊氮鈉、0.004 mmol/L苯甲基磺酰氟和2%碘化乙酰胺；然后離心12 000 r/min，4℃，30 min。取上清液，用含2%TritonX2100的PBS 15 ml重懸，再次離心。取250 μl上清液(粗提AchR) 加2 nmol/L 125I-aBT和鼠抗AchR IgG，4℃包被24 h，然后加羊抗鼠血清4℃，4 h后離心洗滌于r 計數(shù)儀中計數(shù)，將標(biāo)本放于-20℃條件下保存，檢測前在室溫下均勻解凍。之后采用ELISA法測定EAMG大鼠神經(jīng)肌肉接頭處AchR的含量，具體方法按說明書操作。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

表1可見，EAMG大鼠動物模型造模成功后，模型對照組EAMG大鼠神經(jīng)肌肉接頭處AchR表達(dá)水平顯著降低，與空白對照組比較具有極顯著性差異(P<0.01)，證明AchR在EAMG的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要的作用；經(jīng)治療后，針灸治療組和藥物對照組EAMG大鼠AchR的表達(dá)水平均明顯提高，與模型對照組相比均具有顯著性差異(P<0.01)，證明“溫陽補(bǔ)氣”針法和溴吡斯的明對EAMG大鼠經(jīng)肌肉接頭處AchR的表達(dá)水平均具有較好的調(diào)整作用；針灸治療組與藥物對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，說明“溫陽補(bǔ)氣”針法與溴吡斯的明對EAMG的治療效果相近。

表1 各組大鼠腓腸肌神經(jīng)肌肉接頭處AchR表達(dá)水平±s,pg/μl)

3 討 論

AchR-ab與NMJ突觸后膜的AchR特異性結(jié)合，加速AchR的降解，導(dǎo)致突出后膜上AchR數(shù)量減少，阻礙了神經(jīng)電信號的傳導(dǎo)是MG產(chǎn)生的主要原因〔3,4〕。國內(nèi)學(xué)者關(guān)兵峰等〔5〕研究顯示，MG患者的胸腺瘤組織中煙堿型AchR(nAchR)蛋白表達(dá)低于胸腺增生組織；胸腺萎縮組織中nAChR蛋白的表達(dá)也低于正常對照組。陸天宇等〔6〕通過AChR亞基在老年MG患者中的表達(dá)中發(fā)現(xiàn)，胸腺瘤及胸腺中可以檢測到AChR的5個各亞單位，胸腺瘤中AChR各亞單位灰度值/內(nèi)參灰度值均低于肌肉組織，MG肌肉AChR亞單位中除γ亞單位外，均高于正常肌肉亞單位，上述研究結(jié)論均證明AchR的表達(dá)水平增高與MG的發(fā)病存在著密切的聯(lián)系。

國內(nèi)中醫(yī)學(xué)專家〔7～9〕認(rèn)為MG患者多以虛證為主，其病位主要在脾腎二臟，其病機(jī)主要為脾胃虛弱致氣血化生乏源，或腎陽不足至精血虧虛，以致筋肉失于濡養(yǎng)，久之導(dǎo)致機(jī)體頹痿無力?！皽仃栄a(bǔ)氣”針法根據(jù)MG患者脾氣虛弱，腎陽不足的主要病機(jī)，取手陽明經(jīng)穴之手三里，取足陽明經(jīng)穴之足三里，堅持了“治痿獨取陽明”的治療原則；同時，脾為“后天之本”、“氣血生化之源”，腎為“先天之本”，故取脾俞、腎俞兩穴，通過溫補(bǔ)“先天之本”，健運“后天之本”，以調(diào)節(jié)脾腎二臟之虛弱不足，達(dá)到了溫陽補(bǔ)髓、益氣養(yǎng)血、濡潤宗筋，補(bǔ)氣助力、壯肌治痿的治療目的。課題組通過前期的研究工作證實〔10〕，“溫陽補(bǔ)氣”針法可以通過調(diào)節(jié)EAMG大鼠血清中轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達(dá)水平而發(fā)揮治療作用。通過本研究可進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)：“溫陽補(bǔ)氣”針法可以促進(jìn)EAMG大鼠NMJ處AchR表達(dá)水平的增高，增加NMJ突出后膜上AchR的數(shù)量，促進(jìn)神經(jīng)電信號的傳導(dǎo)，從而達(dá)到治療MG的作用。

4 參考文獻(xiàn)

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10王洪峰,吳 瑤,張立娜.“溫陽補(bǔ)氣”針法對EAMG大鼠血清TGF-β和TNF-α水平的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2013；33(23):5884-5.