張琳琳 張素玲 張玉蓮 王 凱 王雪研

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腦病科，天津 300150)

阿爾茨海默病(AD) 是一種進(jìn)行性的以認(rèn)知功能障礙、記憶能力下降為特點(diǎn)的神經(jīng)變性病，主要臨床特征是患者出現(xiàn)智力、記憶力、感覺定向不可逆退化，其特征性的病理改變主要有老年斑(SP)、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)、神經(jīng)元大量丟失〔1〕。從中醫(yī)角度來講，AD是由于“腎精虧虛”、“髓海不足”引起的〔2〕，因此用補(bǔ)腎中藥防治AD有重要的作用。故本研究擬觀察補(bǔ)腎中藥女貞子的有效成分齊墩果酸對快速老化小鼠(SAMP8)海馬神經(jīng)元及APP、PS1基因表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1動物及分組 選擇9月齡(從出生前后±3 d)健康雄性SMAP8 30只，體質(zhì)量 (30±2)g，購自中國生物工程研究所。按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、齊墩果酸組、鹽酸多奈哌齊(安理申)組，每組10只。另取10只SAMR1作為正常組。

1.2藥物配制和干預(yù) 齊墩果酸(純度>99%，批號：110325，購自上海友思生物技術(shù)有限公司)用研缽研磨，混懸于蒸餾水中，制成5 g/L齊墩果酸懸液。齊墩果酸組給予齊墩果酸(50 mg/kg)灌胃治療，1次/d，連續(xù)灌胃4 w。安理申(批號：110507A)，購自衛(wèi)材藥業(yè)有限公司。安理申用研缽研磨，混懸于蒸餾水中，制成0.13 mg/ml的溶液。安理申組給予等量安理申溶液(1.3 mg/kg)灌胃。模型組與正常組均給予等量生理鹽水灌胃。

1.3儀器和試劑 全自動多功能顯微鏡(leica dm rxa2)由德國萊卡公司提供。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real time PCR)試劑如 Oligo dT、dNTP、RNA 抑制酶購自寶生物工程(大連)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄酶、GoTaqGreen Master mix 購自美國Promega公司；Quanti Tect TM SYBR Green PCR Kit購自美國QIAGEN公司；PS1和β-actin Taqman 引物由上海生物工程有限公司合成。實(shí)時(shí)定量PCR儀(RG-3000)，Rotor-Gene生產(chǎn)；PCR儀〔TC-96/g/h(b)〕杭州博日科技有限公司生產(chǎn)。

1.4海馬區(qū)神經(jīng)元光鏡檢測 各組小鼠快速斷頭取腦固定，修塊后浸入PBS，脫水包埋后切片，厚度10 μm，烘干8 h以上進(jìn)行HE染色，將切片置于光鏡下觀察海馬區(qū)神經(jīng)元。

1.5聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測 采用異硫氰酸胍、酚和氯仿抽提法提取組織總RNA。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中按照試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR 擴(kuò)增參照試劑盒說明，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，94℃變性20 s，59 ℃退火加延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

圖1 各組小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察(HE，×40)

2.1光鏡下觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化 圖1可見，R1組可見神經(jīng)元輪廓清楚，突出明顯，核漿比值大，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，著色均勻?yàn)闇\藍(lán)紫色，可見深染的核仁。模型組：全部神經(jīng)細(xì)胞胞體縮小，胞質(zhì)濃縮，核固縮，整個(gè)細(xì)胞深染成紅色，看不到形態(tài)正常的神經(jīng)元。安理申組：一部分神經(jīng)細(xì)胞胞體縮小，胞質(zhì)濃縮，核固縮，可見部分形態(tài)正常的神經(jīng)元；齊墩果酸組：小部分神經(jīng)細(xì)胞胞體縮小，胞質(zhì)濃縮，核固縮，大部分神經(jīng)元細(xì)胞胞體正常，胞質(zhì)完好。

2.2RT-PCR法檢測APP基因的表達(dá) 模型組(1.00±0.00)與正常組(0.37±0.01)相比，APP基因的升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。齊墩果酸組(0.41±0.06)與模型組相比，APP基因表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。安理申組(0.94±0.10)與模型組相比，APP基因表達(dá)量的降低無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3PT-PCR法檢測PS1基因的表達(dá) 模型組(1.00±0.00)與正常組(0.50±0.02)相比，PS1基因的升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。齊墩果酸組(0.55±0.05)與模型組相比，PS1基因表達(dá)量的降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。安理申組(0.92±0.08)與模型組相比，PS1基因表達(dá)量的降低無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

腎中精氣的盛衰嚴(yán)重影響到腦的認(rèn)知功能。腎精充足，髓海有余，腦主智能活動的功能才能充分發(fā)揮。反之，腎精虧虛，髓海失養(yǎng)，則見記憶力減退，智能障礙〔3〕。因此AD病變雖然在腦，但是病源在腎精不足。而采用“補(bǔ)腎生精”的方法治療“癡呆”、“善忘”這類疾病，在延緩和控制疾病的發(fā)展上確有療效〔4〕。

女貞子味甘苦、性涼，歸肝腎經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎、益陰養(yǎng)血之功，是滋補(bǔ)肝腎之良藥，主要用于眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白、目暗不明等癥。齊墩果酸是女貞子的主要有效成分，屬于不飽和三萜化合物。具有護(hù)肝、解毒，降糖、降脂，調(diào)節(jié)免疫和抗氧化的作用〔5〕，對谷氨酸誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷有一定的保護(hù)作用〔6〕。本研究結(jié)果也證實(shí)了齊墩果酸組有激活神經(jīng)元細(xì)胞的趨勢，并且優(yōu)于西藥安理申組，說明了Aβ級聯(lián)假說認(rèn)為，Aβ是AD發(fā)病的核心環(huán)節(jié)，其異常分泌和產(chǎn)生過多導(dǎo)致在特定腦區(qū)內(nèi)聚集，引發(fā)相應(yīng)的神經(jīng)毒性作用，造成突觸損傷，神經(jīng)元死亡〔7〕。目前普遍認(rèn)為聚集狀的Aβ即Aβ1～42具有更強(qiáng)的毒性，且更容易聚集，從而形成Aβ沉淀的核心，引發(fā)神經(jīng)毒性作用〔8〕。PS1基因突變可以導(dǎo)致Aβ1～42/Aβ1～40比例增加，使Aβ毒性增強(qiáng)〔9〕。反之，PS1基因的減少可以一定程度上使Aβ1～42減少，進(jìn)而降低 Aβ的毒性。本研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸對SAMP8海馬DG區(qū)神經(jīng)元有保護(hù)作用；而且齊墩果酸可下調(diào)SAMP8海馬組織內(nèi)APP及PS1基因的表達(dá)。因此推測補(bǔ)腎中藥女貞子可能通過下調(diào)海馬組織APP及PS1基因的表達(dá)，抑制Aβ形成，保護(hù)神經(jīng)元，進(jìn)而起到防治AD的作用。

4 參考文獻(xiàn)

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