王雙雙 王麗麗 楊升華 孔根現(xiàn) 蔣知新

(南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東 廣州 510515)

在前期工作中，本課題組通過液氮凍傷術(shù)結(jié)合高脂飲食喂養(yǎng)成功創(chuàng)建了一種操作簡(jiǎn)單、動(dòng)物死亡率低、成模滿意的與人類斑塊相似的動(dòng)脈粥樣硬化(AS)易損/破裂斑塊(VP)及血栓模型〔1〕。但在后期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該方法高脂飲食飼養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)(10～12 w達(dá)到肉眼明顯斑塊)，易造成動(dòng)物疾病與死亡。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)該造模方法進(jìn)行改良，進(jìn)一步縮短成模時(shí)間，以降低飼養(yǎng)成本。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性新西蘭大白兔24只，體重2.25～2.5 kg，由北京綠洲動(dòng)物中心提供〔許可證號(hào)：SCXK(京)2009-0013〕。

1.2試劑與儀器 高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)酶聯(lián)管免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)自上海藍(lán)基科技有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1單克隆抗體及SP超敏試劑盒購(gòu)自北京冰達(dá)生物科技有限公司；高脂飼料(含1% 膽固醇、3%大油、15% 蛋黃和81% 普通飼料)購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司〔許可證號(hào): SCXK(京)2005- 0007〕；全自動(dòng)生化分析儀DXC800購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司。

1.3方法

1.3.1兔頸動(dòng)脈內(nèi)膜液氮凍傷術(shù) 參照文獻(xiàn)〔1〕，兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，無(wú)菌條件下作頸正中切口，分離右頸總動(dòng)脈，兩端以動(dòng)脈夾阻斷血流，24號(hào)靜脈留置針45傾斜刺入右頸總動(dòng)脈，刺入后抽出針芯，生理鹽水沖洗置換出血管內(nèi)的血液后抽空血管腔。無(wú)菌注射器抽取液氮快速注入右頸總動(dòng)脈，重復(fù)3～5次，每次向外抽出少量靜脈留置針管以更換凍傷部位，歷時(shí)約3 min以造成血管內(nèi)皮凍傷，放開動(dòng)脈夾恢復(fù)血流，壓迫止血，3 d內(nèi)常規(guī)使用抗生素預(yù)防感染。

1.3.2動(dòng)物分組與喂養(yǎng) 24只兔以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為兩組：改良方法組(A組)和傳統(tǒng)方法組(B組)各12只。A 組兔首先高脂飼料喂養(yǎng)1 d，然后實(shí)施右頸總動(dòng)脈內(nèi)膜液氮凍傷術(shù)，術(shù)后高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)；B 組兔子首先進(jìn)行液氮凍傷術(shù)然后給予高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)。6 w末每組各隨機(jī)取4只兔子頸動(dòng)脈觀察斑塊形成情況(A1組及B1組)。A組剩余動(dòng)物(A2組)給予液氮激發(fā)術(shù)。B組剩余動(dòng)物(B2組)繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)至10 w末，并給予液氮激發(fā)術(shù)。液氮激發(fā)術(shù)后48 h處死所有兔子，留取雙側(cè)頸動(dòng)脈血管。所有兔子均自由飲水，按清潔級(jí)動(dòng)物單籠喂養(yǎng)。

1.3.3血液生化檢測(cè) 分別于高脂喂養(yǎng)0、3 d、1、2、4、6及10 w耳緣抽取空腹靜脈血2 ml，并于二次液氮激發(fā)術(shù)前后經(jīng)耳緣靜脈抽取空腹血2 ml，離心取上清液，于-80℃冰箱內(nèi)保存待測(cè)，部分用于檢測(cè)甘油三酯(TG) 、總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)水平，部分采用ELISA法檢測(cè)兔血清hs-CRP水平。

1.3.4病理形態(tài)學(xué)觀察 以過量戊巴比妥鈉處死兔子，取出右側(cè)頸總動(dòng)脈約3.0 cm，縱行剖開，生理鹽水輕輕沖洗干凈后，觀察斑塊大小及斑塊破裂及血栓形成情況。以10%中性福爾馬林溶液固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，血管橫截面作4 μm 連續(xù)切片，分別做HE染色及免疫組織化學(xué)染色，光鏡觀察斑塊的組織結(jié)構(gòu)及斑塊部位MMP-1蛋白的局部表達(dá)情況。免疫組化采用SP法，DAB 顯色，棕黃色顆粒狀產(chǎn)物為陽(yáng)性標(biāo)記，并設(shè)陰性對(duì)照(以PBS 代替一抗)，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 B組3只動(dòng)物出現(xiàn)下肢壞疽，其中1只治療后壞疽得到控制，2只死亡；一只出現(xiàn)耳螨，治療后好轉(zhuǎn)；共22只兔子完成實(shí)驗(yàn)。

2.2血脂變化 高脂飼料喂養(yǎng)3 d后TG、TC及LDL均出現(xiàn)明顯增高，第1周內(nèi)升高幅度最大，第2～10周血脂緩慢增高。與基線血脂水平相比，高脂飼料喂養(yǎng)后3 d、1、2、4、6及10 w的血清TG、TC及LDL均有明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.3血清hs-CRP水平變化 與實(shí)驗(yàn)前相比，高脂喂養(yǎng)1 w后兩組兔血漿hs-CRP即明顯升高，至激發(fā)前進(jìn)一步升高，激發(fā)后hs-CRP較激發(fā)前明顯升高(P<0.05)。各時(shí)間點(diǎn)兩組間比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見表2。

2.4病理形態(tài)學(xué)觀察

2.4.1肉眼大體觀察 B1組兔右頸總動(dòng)脈輕度僵硬，未見明顯串珠樣改變，管腔內(nèi)膜較光滑，肉眼見少量脂樣物質(zhì)沉積，但無(wú)明顯斑塊樣隆起。A組及B2組兔右頸總動(dòng)脈管壁明顯僵硬，粗細(xì)不均，呈串珠樣突出外膜，內(nèi)膜面見大量黃白色脂樣物質(zhì)向管腔突出，并連成片狀。

2.4.2光鏡觀察 圖1可見，A1組可見血管壁內(nèi)明顯向管腔內(nèi)突出的斑塊形成。內(nèi)皮細(xì)胞較完整，斑塊內(nèi)含有大量的泡沫細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，中膜明顯萎縮，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，呈典型的成熟AS斑塊。B1組兔頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞較完整，血管內(nèi)膜輕度增生，內(nèi)膜可見少量脂質(zhì)沉積，少部分內(nèi)膜可見突出斑塊，但斑塊面積明顯小于A1組。A2組及B2組可見血管內(nèi)膜脫落，斑塊脂質(zhì)核心較大(或壞死)，有大量炎癥細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等)浸潤(rùn)，細(xì)胞外基質(zhì)較少，纖維帽較薄。

表1 高脂飼料喂養(yǎng)后不同時(shí)間血脂變化(mmol/L，±s)

圖1 各組不同時(shí)期頸動(dòng)脈斑塊形態(tài)(HE，×100)

2.4.3免疫組織化學(xué)檢測(cè) A1組及B1組斑塊處有MMP-1的局部表達(dá)，而A2組及B2組斑塊處均有MMP-1蛋白的大量表達(dá)。其中MMP-1陽(yáng)性細(xì)胞主要位于斑塊纖維帽及肩部，斑塊內(nèi)部也有其大量表達(dá)(圖2)。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)血清hs-CRP的變化(ng/ml，±s)

圖2 各組頸動(dòng)脈斑塊MMP1的表達(dá)水平(免疫組化法，×100)

3 討 論

AS斑塊的破裂和繼發(fā)血栓形成是急性心血管事件的主要病因〔2〕。VP的早期識(shí)別和干預(yù)對(duì)于急性心血管事件的預(yù)防具有十分重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，A1組的動(dòng)物在高脂飲食6 w即已形成明顯頸動(dòng)脈斑塊，內(nèi)膜大量黃色脂質(zhì)物沉積，病理觀察呈典型的成熟動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。B1組高脂飲食6 w時(shí)可見頸動(dòng)脈內(nèi)膜有少量脂質(zhì)物沉積，病理切片見血管內(nèi)粥樣斑塊面積較小。其出現(xiàn)明顯差別的原因可能為A1組液氮凍傷損傷血管內(nèi)膜前動(dòng)物體內(nèi)血脂已經(jīng)達(dá)到較高水平，其中TC、LDL升高達(dá)基線水平的10余倍，血管局部可能已有脂質(zhì)沉積。液氮凍傷后，損傷的內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子和趨化因子，招募單核-巨噬細(xì)胞在局部聚集吞噬大量脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞。進(jìn)一步放大局部炎性及吞噬反應(yīng)，促使AS斑塊形成。而在實(shí)驗(yàn)中觀察到B1組動(dòng)物液氮凍傷后3 d內(nèi)進(jìn)食量減少(考慮與頸部傷口疼痛及飼料更換有關(guān))，血脂水平無(wú)法迅速升高，而血管內(nèi)膜損傷后可自我修復(fù)，致使內(nèi)膜損傷和損傷處脂質(zhì)沉積過程不同步，可能致使斑塊形成速度較慢。但是B2組動(dòng)物證明，延長(zhǎng)高脂飲食時(shí)間也可導(dǎo)致AS斑塊形成。研究表明單純的高脂飼料喂養(yǎng)也可導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)炎性因子如C反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α等增加〔3〕，本實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這種結(jié)果。炎性因子的增加可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。A組先給予高脂喂養(yǎng)，不但更有利于液氮凍傷術(shù)后血管內(nèi)膜損傷處脂質(zhì)沉積；也可使體內(nèi)炎性因子增加，放大并延續(xù)液氮損傷術(shù)對(duì)內(nèi)膜的損傷作用，使脂質(zhì)沉積加快，更易形成斑塊內(nèi)較大的脂質(zhì)核心，有利于不穩(wěn)定斑塊模型的制作。另外，改良方法造模時(shí)間相對(duì)較短，血管平滑肌分泌膠原含量相對(duì)較少，斑塊纖維帽相對(duì)較薄，更利于制作不穩(wěn)定斑塊模型。而適當(dāng)縮短高脂喂養(yǎng)時(shí)間也可避免斑塊過大，使其更接近不穩(wěn)定斑塊的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

斑塊內(nèi)炎癥是引起斑塊不穩(wěn)定的關(guān)鍵因素〔4〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，二次液氮凍傷后，由于內(nèi)皮損傷、斑塊破裂，導(dǎo)致斑塊內(nèi)大量炎性細(xì)胞通過黏附分子和化學(xué)趨化因子被募集到斑塊中并且在氧化脂質(zhì)、細(xì)胞因子等作用下被激活，合成分泌大量的炎性因子(如白細(xì)胞介素類，TNF-α)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，前者促進(jìn)炎癥反應(yīng)，后者主要降解細(xì)胞外基質(zhì)，使斑塊內(nèi)膠原、彈性蛋白含量較少，從而增加斑塊的不穩(wěn)定性〔5〕。國(guó)內(nèi)外研究表明MMP-1與AS斑塊破裂之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系，即MMP-1含量越高之處，斑塊越易破裂〔6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示改良方法傳統(tǒng)方法制作的VP與人體內(nèi)易損斑塊MMP-1的變化趨勢(shì)相同。

另外，在液氮凍傷術(shù)采用的器械方面，本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)行了調(diào)整。前期試驗(yàn)采用1 ml針頭刺入血管進(jìn)行液氮凍傷操作，在二次液氮激發(fā)術(shù)時(shí)，由于血管內(nèi)已經(jīng)形成較大斑塊，針頭刺入后極易損傷斑塊，造成斑塊器械性破壞，損傷標(biāo)本。本實(shí)驗(yàn)采用24號(hào)靜脈留置針，雖然針孔較大，需更長(zhǎng)時(shí)間的按壓止血，但是血管內(nèi)斑塊不易被損傷，保證了二次液氮凍傷激發(fā)斑塊破裂的可靠性。

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