姚 佳 彭 梅 胡江義 肖 雄 唐健波 楊 娟

(貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550002)

阿霉素(ADM)屬蒽環(huán)類抗生素，具有抗瘤譜廣、作用強(qiáng)的特點(diǎn)，是目前最常用的抗腫瘤藥物之一，其不良反應(yīng)較多，最嚴(yán)重的是劑量依賴性心臟毒性，主要表現(xiàn)為心肌收縮力影響，嚴(yán)重時(shí)為充血性心力衰竭，正是由于ADM的心臟毒性限制了其臨床應(yīng)用〔1，2〕。因此探討ADM所致心臟毒性的機(jī)制，尋找有效的防護(hù)藥物具有重要意義。與單純使用化療藥物相比，與生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑合用能更有效地提高機(jī)體的免疫力，減少化療藥物劑量，增強(qiáng)抑瘤效果，保證化療順利完成。多糖由于它的高效、低毒，被認(rèn)為是理想的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。仙茅多糖(COP)是從仙茅根莖中經(jīng)水提醇沉后得到，具有調(diào)劑免疫、抗氧化作用〔3，4〕。本文通過(guò)動(dòng)物模型，探討COP對(duì)小鼠心肌損傷的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)KM小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(渝)2007-001。

1.2藥品與試劑 COP由本課題組提供，多糖含量≥50%；阿霉素(深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司，批號(hào)1103E3)；維生素E軟膠囊(湖南中和制藥有限公司，批號(hào)120301)；血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20120904、20120903、20120 905、20120904、20120905、20120904)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3主要儀器 FA114精密電子天平(上海?？惦娮觾x器廠)；MD Spectra Max-190連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司)；OLMYPUS顯微鏡CX31(日本奧林巴斯)；Eppendorf 5418R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物分組及給藥 KM小鼠70只，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為空白組：灌胃(ig)生理鹽水，0.2 ml/10 g，1次/d，連續(xù)15 d；ADM組：腹腔注射(ip)注射ADM 3 mg/kg，1次/d，連續(xù)給藥5 d；COP組：每日ig COP 400 mg/kg，連續(xù)給藥15 d；ADM+COP低、中、高劑量組：建模同ADM組，同時(shí)每日分別ig COP 300、400、500 mg/kg；VitE組：建模同ADM組，同時(shí)每日ig VitE 2 mg/kg，連續(xù)15 d。每組10只，雌雄各半。

1.4.2血清生化指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后小鼠眼眶取血，4 000 r/min離心15 min，取血清置4℃冰箱保存?zhèn)溆茫丛噭┖姓f(shuō)明測(cè)定血清CK、LDH、GOT、NOS、SOD和MDA。

1.4.3心肌生化指標(biāo)檢測(cè) 按上述方法取完血后迅速取出小鼠心臟，剪下一半迅速稱重，放入-20℃條件冰凍，將速凍的心臟組織取出，冰浴條件下用勻漿器反復(fù)研磨，用生理鹽水(使用前放至4℃冰箱預(yù)冷)按1∶9比例制成10% 的勻漿3 500 r/min離心10 min，取上清液置4℃冰箱備用，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定SOD活性和MDA含量。

1.4.4病理學(xué)檢查 取上述未勻漿的部分心臟組織，10%多聚甲醛固定，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下檢查。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 組間比較行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1COP對(duì)小鼠血清GOT、CK、LDH、NOS活力的影響 與空白組比較，ADM組GOT、CK、LDH、NOS活力均顯著增加(P< 0.01)；與ADM組比較，ADM和COP低、中、高劑量合用組以及陽(yáng)性對(duì)照VE組以上各指標(biāo)均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2COP對(duì)小鼠血清和心臟SOD和MDA的影響 與空白組比較，ADM組血清和心臟MDA含量增加，SOD活力降低(P<0.01)；而與ADM組比較，VE、ADM和COP合用各組MDA含量明顯降低，SOD活力增加(P<0.05或P<0.01)。

2.3病理學(xué)檢查 光學(xué)顯微鏡下觀察正常小鼠心肌細(xì)胞完整，排列整齊，細(xì)胞間隙均勻，肌纖維之間紅細(xì)胞極少，未見(jiàn)水腫，細(xì)胞核清晰；ADM組心肌細(xì)胞呈不同程度的空泡變性，肌纖維斷裂，肌纖維間隙紅細(xì)胞堆積，細(xì)胞核模糊。ADM聯(lián)合COP各組心肌細(xì)胞輕度腫脹，幾乎無(wú)心肌細(xì)胞空泡樣變，肌纖維完整。見(jiàn)圖1。

表1 COP對(duì)小鼠血清GOT、CK、LDH、NOS活力的影響±s，n=10)

表2 COP對(duì)小鼠血清和心臟 SOD和MDA的影響±s，n=10)

圖1 各組小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)(HE，×400)

3 討 論

ADM被用作一種高效、廣譜的抗腫瘤藥物已有近40年的歷史，對(duì)乳腺癌、食道癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、Kaposi肉瘤和軟組織肉瘤均有較好的療效〔5〕。但是ADM與心肌細(xì)胞的高親和力使其在治療腫瘤的同時(shí)，存在劑量依賴性心臟毒性。ADM進(jìn)入心肌后，被微粒體還原型輔酶Ⅱ(NADHP)及細(xì)胞色素P450還原酶催化為半醌代謝物，直接損傷細(xì)胞核和細(xì)胞成分，引起細(xì)胞損傷〔6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示3 mg/kg ADM 就能誘發(fā)小鼠明顯的心肌損傷。

正常情況下，細(xì)胞中存在著完整的抗氧自由基(OFR)酶系統(tǒng)，如SOD、過(guò)氧化氫酶(CAT)及過(guò)氧化物酶(POD)，它們通過(guò)各自的反應(yīng)清除OFR，使細(xì)胞免受損傷。ADM使心肌細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)清除OFR的內(nèi)源性抗氧化劑活性降低，不能有效地保護(hù)心肌細(xì)胞免受OFR的損傷〔7～9〕。大量研究〔10～13〕表明，ADM所致心臟毒性與氧化應(yīng)激有關(guān)，表現(xiàn)在ADM誘發(fā)心肌損傷的同時(shí)可引起脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(如MDA)含量增多，抗氧化酶(如SOD)活性下降。組織中MDA含量可反映脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，并間接反映該組織損傷情況。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激酶，MDA、SOD被研究學(xué)者視為藥物干預(yù)ADM心臟毒性藥效學(xué)研究的重要指標(biāo)。研究顯示提高抗氧化酶的活性可對(duì)不同形式的氧化性損傷具有保護(hù)作用。

同時(shí)大量研究〔14～16〕表明，NO在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激與組織損傷過(guò)程中起重要作用，是由NOS催化L-精氨酸和分子氧反應(yīng)而生成的氧化產(chǎn)物。機(jī)體內(nèi)NOS有cNOS和iNOS兩種，一般可根據(jù)基因表達(dá)和所需輔助因子來(lái)區(qū)分。正常生理情況下，iNOS的基因不表達(dá)，只有在內(nèi)毒素和某些細(xì)胞因子的刺激下才得以和表達(dá)，并在輔助因子和NADPH的作用下生成大量的NO。據(jù)報(bào)道，NO與超氧化物陰離子(O2-)反應(yīng)生成超氧亞硝基陰離子(ONOO-)，后者可分解羥自由基(OH)而產(chǎn)生毒性，造成細(xì)胞或組織的損傷〔17〕。本研究結(jié)果表明，在注射 ADM后NOS含量明顯高于空白對(duì)照組，推測(cè)NOS的產(chǎn)生可能是由于氧化應(yīng)激反應(yīng)中自由基引起的。NOS產(chǎn)生增加，引起NO釋放，導(dǎo)致心肌病理?yè)p傷，NOS含量變化與血清GOT、CK、LDH變化完全一致。

4 參考文獻(xiàn)

1王桂英，王永梅，張麗男，等.白藜蘆醇對(duì)阿霉素致心衰大鼠心肌損傷的保護(hù)作用〔J〕.中國(guó)中藥雜志，2007；32(15)：1563-5.

2余 薇，吳基良.大蒜多糖對(duì)阿霉素所致小鼠心臟毒性的拮抗作用〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2005；21(1)：96-9.

3余曉紅.仙茅多糖對(duì)小鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.海峽藥學(xué)，2011；23(7)：33-5.

4張振東，吳蘭芳，景永帥，等.仙茅提取物體外抗氧化活性研究〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009；29(24)：3201-3.

5He L,Xiao JM,Fu H,etal.Effect of oxidative stress on ventricular arrhythmia in rabbits with adriamycin-induced cardiomyopathy〔J〕.J Huazhong Univ Sci Technol,2012;32(3):334-9.

6Chen T,Hu YQ,Deng LR,etal.Effects of polysaccharides extracted from Zhu Zi Shen (Rhizoma Panacis Majoris) on oxidative stress and hemodynamics in rats with adriamycin-induced chronic heart failure〔J〕.J Tradit Chin Med,2011;31(3):235-40.

7Fearon WF,Fearon DT. Inflammation and cardiovascular disease: role of the interleukin -1 receptor antagonist〔J〕.Circulation,2008;117(20):2577-9.

8Rajasekaran M,Kalaimagal C.Cardioprotective effect of a medicinal mushroom,iucidum against adriamycin induced toxicity〔J〕.Int J Pharmacol,2012;8(4):252-8.

9何 玲，孫桂波，孫 瀟，等.木犀草苷對(duì)阿霉素誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012；28(9)：1229-34.

10Zhao DM,Yang P.Effects of combined atorvastatin/coenzyme Q10 on myocardial fibrosis and malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) in rat of heart failure〔J〕.Heart，2010;96(3): 76.

11孫 萌，范 穎，于彩娜，等.姜附湯對(duì)阿霉素心臟毒性大鼠心肌細(xì)胞SOD、GPH-Px、 MDA的影響〔J〕.中醫(yī)藥信息，2011；28(2)：58-60.

12Zhang S,He B,Ge J,etal.Characterization of chemical composition of Agaricus brasiliens is polysaccharides and its effect on myocardial SOD activity,MDA and caspase-3 level in ischemia-reperfusion rats〔J〕.Int J Biol Macromol,2010;46(3):363-6.

13Liu M,Chang XR,Yan J,etal.Effects of moxibustion pretreatment on GSH-Px,SOD and MDA in gastric mucosa of rats with stress ulcer 〔J〕.J Acupuncture Tuina Sci,2011;9(1):17-20.

14Saber AS,Samah MA. Effect of fenugreek seed extract on adriamycin-induced hepatotoxicity and oxidative stress in albino rats〔J〕.Toxicol Ind Health,2012;28(10):876-85.

15Nathan DR,Jun R.Nitric oxide synthase uncoupling: A therapeutic target in cardiovascular diseases〔J〕.Vasc Pharmacol,2012;57(5):168-72.

16辛艷飛，張麗麗，宣堯仙，等.一氧化氮在阿霉素心臟毒性中的雙重作用〔J〕.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2009；14(1)：117-9.

17朱勁舟，韓 偉,張 晶，等.白細(xì)胞介素-1家族在小鼠阿霉素心臟毒性模型中的表達(dá)〔J〕.國(guó)際心血管病雜志，2010；37(2):119-21.