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KLF4通過上調(diào)Mfn2表達(dá)減輕棕櫚酸致L6骨骼肌細(xì)胞的胰島素抵抗

2014-09-13 06:25趙志英
中國老年學(xué)雜志 2014年21期
關(guān)鍵詞:骨骼肌抵抗葡萄糖

張 哲 趙志英 王 超

(河北省人民醫(yī)院 河北省老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室,河北 石家莊 050051)

長期胰島素抵抗與糖尿病、肥胖及高血壓等心血管疾病的發(fā)病密切相關(guān),而骨骼肌是胰島素刺激下機(jī)體攝取并利用葡萄糖的主要靶器官〔1〕。線粒體融合蛋白(Mfn)2是表達(dá)在線粒體外膜上的一個具有多重生物學(xué)活性的細(xì)胞內(nèi)分子,具有促進(jìn)線粒體融合并維持線粒體形態(tài)和功能的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn),在多種胰島素抵抗的動物及細(xì)胞模型中均存在Mfn2表達(dá)減低,充分證實了線粒體損傷和功能異常是胰島素抵抗發(fā)生的重要病理機(jī)制〔2,3〕。Krüppel樣因子(KLF)4是一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子,在細(xì)胞增殖、分化、血管形成、腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮廣泛的調(diào)控作用〔4〕。有研究發(fā)現(xiàn)KLF4可直接與Mfn2基因的啟動子序列結(jié)合促進(jìn)Mfn2的表達(dá),二者共同參與血管平滑肌細(xì)胞的分化〔5〕。然而,KLF4在骨骼肌胰島素抵抗中的作用目前尚未見報道。本實驗旨在觀察KLF4/Mfn2對胰島素抵抗的影響。

1 材料與方法

1.1材料 L6骨骼肌細(xì)胞株購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心。α-MEM、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶購自美國GIBCO公司。青霉素、鏈霉素、棕櫚酸、葡萄糖氧化酶試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。兔抗KLF4、Mfn2、胰島素受體(IR)、GLUT4、GAPDH多克隆抗體購自美國Sigma公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 2000購自Invitrogen 公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。Trizol、RT-PCR試劑盒購自Promega 公司。PCR引物及靶向Mfn2 mRNA的siRNA由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 在5% CO2、37℃飽和濕度條件下,將復(fù)蘇后的大鼠L6骨骼肌細(xì)胞接種在含10% FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。2 d后更換含2% FBS的α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),每天換液一次,直至細(xì)胞長出肌管。

1.2.2胰島素抵抗模型的建立及鑒定

1.2.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 采用棕櫚酸體外誘導(dǎo)培養(yǎng)法建立L6骨骼肌細(xì)胞的胰島素抵抗模型。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后轉(zhuǎn)入24孔板中,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/孔。待細(xì)胞形成成熟肌細(xì)胞后,隨機(jī)分為對照組和誘導(dǎo)組。對照組每孔加入不含棕櫚酸的α-MEM培養(yǎng)基,誘導(dǎo)組每孔加入含0.3 mmol/L棕櫚酸的α-MEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h待用。

1.2.2.2葡萄糖消耗實驗 將對照組和誘導(dǎo)組細(xì)胞用預(yù)冷0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次,先加入含100 ng/ml胰島素的正常培養(yǎng)基孵育30 min,再加入5.6 mmol/L葡萄糖孵育24 h。采用葡萄糖氧化酶法測定細(xì)胞上清液中葡萄糖濃度,操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3重組腺病毒轉(zhuǎn)染

1.2.3.1重組腺病毒的構(gòu)建 采用基因重組技術(shù),將大鼠全長 KLF4 cDNA序列及靶向Mfn2 mRNA的siRNA克隆到腺病毒表達(dá)載體pAd/CMV/V5-DEST中。酶切和測序鑒定后,將空載體病毒及重組腺病毒利用Lipofectamin 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染A293細(xì)胞,包裝和擴(kuò)增后得到重組腺病毒質(zhì)粒Ad-KLF4和Ad-Mfn2-siRNA。轉(zhuǎn)染24 h后,反復(fù)凍融裂解細(xì)胞并收集上清液,用0.3 g/L G418篩選陽性克隆并培養(yǎng)14 d。利用Real-time PCR和Western印跡檢測KLF4和Mfn2表達(dá)情況。

1.2.3.2細(xì)胞分組 將誘導(dǎo)成功的L6骨骼肌細(xì)胞隨機(jī)分為空載體對照組(Ad)和轉(zhuǎn)染組(Ad-KLF4和/或Ad-Mfn2-siRNA),繼續(xù)培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.2.4Real-time PCR 根據(jù)GenBank中大鼠KLF4、Mfn2、IR、GLUT4 mRNA序列,采用DNAMAN軟件設(shè)計引物,引物序列見表1。Trizol提取各組細(xì)胞總RNA,用紫外分光光度計鑒定RNA的純度并定量。參考北京全式金生物技術(shù)有限公司 EasyScript First-strand cDNA synthesis SuperMix 試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。PCR 反應(yīng)按照Syber Green I GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行操作。擴(kuò)增完畢,進(jìn)入ABI 7300型熒光定量PCR儀附帶的SDS v1.3軟件結(jié)果分析界面,設(shè)基線為3~15個循環(huán),得到各樣本、各基因擴(kuò)增的Ct值。設(shè)對照組樣品為標(biāo)準(zhǔn)1,目的基因表達(dá)水平的相對定量值RQ=2-△△Ct,將RQ值用于統(tǒng)計分析,設(shè)GAPDH為內(nèi)參照基因。

表1 KLF4、Mfn2、IR、GLUT4、GAPDH引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

1.2.5Western印跡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品按4∶1體積比加入5×上樣緩沖液內(nèi)混勻,100℃煮沸5 min變性,置于-20℃冰箱備用。將100 μg總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,10% 脫脂奶粉封閉2 h。用特異性一抗(1∶2 000稀釋) 4 ℃孵育過夜,TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h,洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。用UVP軟件分析,檢測蛋白條帶IOD值。

2 結(jié) 果

2.1兩組葡萄糖代謝水平的比較 誘導(dǎo)組細(xì)胞上清液中葡萄糖濃度〔(13.09±2.52)mmol/L〕顯著增加,與對照組〔(3.74±0.12)mmol/L〕比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示棕櫚酸誘導(dǎo)L6肌細(xì)胞胰島素抵抗模型建立成功。

2.2對照組和誘導(dǎo)組KLF4、Mfn2、IR、GLUT4表達(dá)的比較 以GAPDH為內(nèi)參照,Real-time PCR和Westernw印跡結(jié)果顯示,誘導(dǎo)組細(xì)胞KLF4、Mfn2、IR、GLUT4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均有顯著下降,分別相對下降了(60.52±7.43)%和(57.84±6.73)%、(54.28±3.62)%和(52.16±4.52)%、(46.63±6.21)%和(44.04±5.45)%、(44.01±6.08)%和(42.43±5.22)%,且葡萄糖代謝能力顯著降低,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 棕櫚酸刺激對KLF4、Mfn2、IR、GLU4表達(dá)的影響

2.3Ad-KLF4轉(zhuǎn)染L6骨骼肌細(xì)胞對Mfn2、IR、GLUT4 表達(dá)和葡萄糖代謝的影響 結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染L6骨骼肌細(xì)胞48 h后,重組腺病毒Ad-KLF4組 KLF4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均有顯著升高,分別相對增加了(240.61±28.33)%和(222.52±20.46)%與空載體對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示Ad-KLF4能夠轉(zhuǎn)染并高效表達(dá)于L6骨骼肌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染Ad-KLF4后Mfn2、IR、GLUT4表達(dá)水平明顯上調(diào),mRNA和蛋白表達(dá)水平分別相對增加了(183.16±35.02)%和(177.62±30.24)%、(151.22±29.34)%和(143.21±21.32)%、(159.31±32.12)%和(145.43±25.11)%,細(xì)胞對葡萄糖的代謝能力亦明顯改善。見圖2。

2.4Ad-Mfn2-siRNA轉(zhuǎn)染L6骨骼肌細(xì)胞對Mfn2、IR、GLUT4表達(dá)和葡萄糖代謝的影響 結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染L6肌細(xì)胞48 h后,重組腺病毒Ad-Mfn2-siRNA組Mfn2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均有顯著降低,分別相對降低了(74.42±6.18)%和(80.35±7.32)%,與空載體對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示siRNA成功干擾了L6骨骼肌細(xì)胞Mfn2的表達(dá)。另外,Ad-Mfn2-siRNA不影響Ad-KLF4的高表達(dá),但I(xiàn)R、GLUT4表達(dá)水平未見升高,與空載體對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。細(xì)胞對葡萄糖的代謝能力亦無改善。

圖2 過表達(dá)KLF4對Mfn2、IR、GLUT4表達(dá)和葡萄糖代謝水平的影響

3 討 論

胰島素抵抗Mfn2通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位和氧化磷酸化系統(tǒng)調(diào)控線粒體代謝,而Mfn2表達(dá)減低和線粒體代謝紊亂是胰島素抵抗發(fā)生的重要機(jī)制之一。本課題組前期研究證實,體外造成胰島素抵抗的肝細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞模型均存在Mfn2低表達(dá),與國外報道一致〔6,7〕。

KLF4是一種具有結(jié)合位點(diǎn)特異性的鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子,羧基端含有3個連續(xù)且高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)(Cχ2-4CX3FX5Lχ2HX3H),此為該家族的典型結(jié)構(gòu)特征。 KLF4通過與p53、細(xì)胞周期蛋白D1等下游基因啟動子區(qū)的結(jié)合元件結(jié)合調(diào)控目的基因轉(zhuǎn)錄,在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮廣泛的調(diào)控作用。迄今研究發(fā)現(xiàn),KLF4與腫瘤發(fā)生、皮膚屏障形成、睪丸發(fā)育等生理、病理過程密切相關(guān)〔8〕。

2010年,Rui等〔5〕采用報告基因分析發(fā)現(xiàn)Mfn2啟動子區(qū)存在KLF4的結(jié)合位點(diǎn)(CACCC/GTGGG),KLF4可激活Mfn2基因轉(zhuǎn)錄,二者在調(diào)控大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的信號網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。既然血管平滑肌細(xì)胞Mfn2可被KLF4誘導(dǎo)表達(dá),我們推測在骨骼肌細(xì)胞中也有相似作用。本文結(jié)果顯示胰島素抵抗的L6骨骼肌細(xì)胞Mfn2、IR、GLUT4表達(dá)和葡萄糖代謝明顯下降,KLF4過表達(dá)可上調(diào)Mfn2、IR、GLUT4的表達(dá)并改善骨骼肌細(xì)胞的胰島素抵抗。相反,采用siRNA技術(shù)造成Mfn2基因沉默后,KLF4對上述基因表達(dá)的上調(diào)作用和骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗的改善作用并未出現(xiàn),提示 KLF4參與了骨骼肌胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展,其機(jī)制可能與調(diào)控Mfn2表達(dá)有關(guān)。

KLF4在細(xì)胞內(nèi)的信號調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全闡明。多項研究表明,KLF4和p300相互作用造成KLF4乙酰化后通過增強(qiáng)腸堿性磷酸酶、p21、Mfn2啟動子活性促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)〔5,9〕。在骨骼肌細(xì)胞,KLF4是否通過上述機(jī)制調(diào)控Mfn2基因表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。而Mfn2促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制可能與GLUT4的轉(zhuǎn)位和激活有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示,上調(diào)KLF4表達(dá)后,Mfn2和GLUT4的表達(dá)均明顯增加,二者呈協(xié)同作用,與上述觀點(diǎn)一致。GLUT4是肌肉和脂肪細(xì)胞膜上參與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要蛋白分子,其表達(dá)水平和活性與胰島素抵抗的形成有重要聯(lián)系。有研究發(fā)現(xiàn),GLUT4對葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)過程可被胰島素依賴的和非胰島素依賴的機(jī)制調(diào)控〔10〕。胰島素通過刺激Akt和MAPK信號途徑激活GLUT4,促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖的攝取。而AMPK通路主要介導(dǎo)非胰島素依賴的糖轉(zhuǎn)運(yùn)。本課題組最近研究發(fā)現(xiàn),Mfn2過表達(dá)通過AMPK途徑上調(diào)GLUT4的表達(dá),這可能是Mfn2改善骨骼肌胰島素抵抗的機(jī)制之一〔2〕。

4 參考文獻(xiàn)

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