符丹丹 歐陽(yáng)瑤 薛令合

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸一科,貴州 遵義 563000)

慢性阻塞性肺病(COPD)發(fā)病機(jī)制與患者氣管或支氣管的炎癥反應(yīng)聯(lián)系緊密〔1〕。在氣道的炎癥反應(yīng)里，CC趨化因子配體(CCL)20可發(fā)揮介導(dǎo)樹突細(xì)胞(DCs)的遷徙成熟，同時(shí)聚集在氣道的上皮黏膜等作用。而CCR6是CCL20的相關(guān)受體，通常表達(dá)于并未成熟的DCs，能夠趨化表達(dá)機(jī)體CCR6的細(xì)胞朝抗原產(chǎn)生的組織部位進(jìn)行定向遷徙〔2〕。本文將CD40和CD86作為DCs的有關(guān)表面標(biāo)志，探討其與第1秒用力呼氣容積(FEV1)占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1%)的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1臨床資料 選擇2008年1月到2009年3月在我院進(jìn)行住院治療的患者51例作為研究對(duì)象，男42例，女9例，年齡60～86〔平均(72.3±2.4)〕歲。參考《根據(jù)2007版COPD全球倡議(GOLD)評(píng)價(jià)》〔3〕將患者依照病情的輕重程度分為無吸煙組5例，年齡60～81〔平均(71.9±1.9)〕歲；吸煙但無COPD組5例，年齡60～80〔平均(71.7±2.2)歲；GOLDⅠ組11例，年齡61～79〔平均(68.9±7.4)〕歲；GOLDⅡ組17例，年齡62～78〔平均(68.7±6.3)〕歲。GOLDⅢ～Ⅳ組13例，年齡60～77〔平均(72.9±6.5)〕歲?；颊呷朐寒?dāng)天即可采集數(shù)據(jù)資料，并對(duì)COPD患者的疾病嚴(yán)重程度實(shí)施臨床評(píng)估。

1.2研究方法

1.2.1指標(biāo)檢測(cè) 主要試劑：(1)美國(guó)BD公司的抗人CD40的單抗-PE標(biāo)記；(2)美國(guó)BD公司的抗人CD86的單抗-異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記；(3)上海銳通公司和美國(guó)IND公司的CCR6試劑盒。經(jīng)氧氣霧化吸入法對(duì)受試者誘導(dǎo)痰進(jìn)行收集，選擇改良pin法和常用梯度的高滲鹽水法。其中試劑配制為3%和4%以及5%的高滲鹽水，0.1%二硫蘇糖醇(DTT)。

1.2.2痰液處理 (1)稱重痰液，加進(jìn)2倍體積0.1%DTT混合均勻，并置于漩渦振蕩器內(nèi)混勻；(2)放置在37℃的恒溫水浴箱內(nèi)孵育和振蕩約30 min，而后加入和DTT相等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)液，水浴震蕩約5 min；(3)稀釋痰液通過四層的無菌紗布進(jìn)行過濾，將濾液置入離心機(jī)內(nèi)經(jīng)1 000 r/min離心約10 min，而后取上清液，放入-80℃的冰箱內(nèi)保存；(4)將細(xì)胞層(沉淀)以D-PBS重懸，經(jīng)300目的尼龍網(wǎng)過濾，以1 000 r/min離心10 min，2次，吸管吸除上清液；(5)將沉淀經(jīng)D-PBS重懸，于顯微鏡下將細(xì)胞數(shù)調(diào)至1×106/ml；(6)加入到2個(gè)流式細(xì)胞儀的專用試管中，將其中的一個(gè)管作自身對(duì)照管，另一管則加進(jìn)鼠抗人CD40，PE 5 μl以及鼠抗人CD86，F(xiàn)ITC 5 μl用作待測(cè)的標(biāo)本管，在加進(jìn)試劑的同時(shí)漩渦混勻；(7)在室溫下避光孵育約30 min，并用尼龍網(wǎng)過濾，在4℃的避光條件下經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定；(8)將上清液在ELISA實(shí)驗(yàn)之前1 d置入密封的冷凍干燥機(jī)中實(shí)施樣本濃縮約12 h，最后取出解凍備用。

2 結(jié) 果

2.1各組患者肺功能情況對(duì)比 GOLD Ⅰ組和GOLD Ⅱ組及GOLD Ⅲ～Ⅳ組的FEV1%，F(xiàn)EV1/用力肺活量(FVC)均顯著低于無吸煙組以及吸煙但無COPD組；GOLD Ⅱ組和GOLD Ⅲ～Ⅳ組的FEV1%與FEV1/FVC水平亦分別顯著低于GOLD Ⅰ組水平；GOLD Ⅲ～Ⅳ組的FEV1%與FEV1/FVC水平顯著低于GOLD Ⅱ組水平(均P<0.05)。見表1。

表1 各組患者肺功能情況對(duì)比±s)

2.2各組患者痰CD40、CD86及CCR6水平對(duì)比 GOLD Ⅰ組和GOLD Ⅱ組及GOLD Ⅲ～Ⅳ組的CD40、CD86、CCR6均顯著高于無吸煙組以及吸煙但無COPD組；GOLD Ⅱ組和GOLD Ⅲ～Ⅳ組的CD40與CD86，以及CCR6水平亦分別顯著高于GOLD Ⅰ組水平；GOLD Ⅲ～Ⅳ組的CD40、CD86、CCR6水平顯著高于GOLD Ⅱ組水平(均P<0.05)。見表2。

表2 各組患者痰CD40、CD86及CCR6水平對(duì)比±s，pg/ml)

2.3DCs、CCR6與FEV1%的相關(guān)性分析 DCs與FEV1%呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.913，P=0.000)，CCR6與FEV1%呈負(fù)相關(guān)(r=-0.892，P=0.000)。

3 討 論

本文表明伴隨COPD癥狀嚴(yán)重程度的增加，患者肺功能逐漸惡化，符合苗麗君等〔4〕報(bào)道結(jié)果，也符合臨床COPD患者的實(shí)際情況。而CCR6含量較無吸煙的健康對(duì)照組以及吸煙但無COPD組而言，在氣道內(nèi)有顯著上升的趨勢(shì)〔5〕。此結(jié)果符合羅紅艷等〔6〕的報(bào)道，此前的研究表明，CCL20在COPD的誘導(dǎo)痰內(nèi)有顯著增加，并結(jié)合機(jī)體CCL20/CCR6具有的抗原提呈效果，同時(shí)CCR6又在未成熟的DCs內(nèi)表達(dá)，而DCs水平的增加又可說明CCR6/CCL20間的相互作用有著較為強(qiáng)大的趨化作用〔7〕。這同時(shí)也提示CCL20參與到患者COPD氣道炎癥時(shí)，CCR6亦發(fā)揮較為重要的作用，與DCs參與到COPD發(fā)病過程有一定聯(lián)系。有報(bào)道稱〔8〕，DCs水平在COPD患者機(jī)體中的數(shù)目有所增大，同時(shí)主要表現(xiàn)在直徑<2 mm的小氣道DCs數(shù)目變多。雖然臨床上亦有相反結(jié)論，但總體而言，大都支持長(zhǎng)期吸煙可降低DCs成熟及相應(yīng)功能，同時(shí)增大肺部的反復(fù)感染機(jī)會(huì)及惡化頻率，從而加速患者COPD的進(jìn)程這一結(jié)論〔9〕。此外，DCs與FEV1%呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，CCR6與FEV1%呈負(fù)相關(guān)，與劉輝國(guó)等〔10〕報(bào)道一致，表明DCs及CCR6與患者肺功能水平的變化密切相關(guān)。CCR6主要表達(dá)在未成熟DCs之上，是一類趨化因子受體，其對(duì)于DCs募集和趨化過程而言，能夠發(fā)揮關(guān)鍵作用。CCR6具有的特殊性決定了其僅可和配體CCL20進(jìn)行結(jié)合，形成CCR6/CCL20〔11〕。一項(xiàng)分離肺部DCs的研究發(fā)現(xiàn)，其中的確存在CCR6水平的表達(dá)，證實(shí)機(jī)體肺部確實(shí)也存在CCR6/CCL20。本次研究選擇的COPD患者普遍為長(zhǎng)期大量的吸煙人群(人均>400年支)，國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)存在吸煙病史的COPD患者其誘導(dǎo)痰內(nèi)CD40及CD86表達(dá)和CCR6水平均顯著上升，充分表明DCs和CCR6在患者的氣道浸潤(rùn)中顯著增加〔12〕。正常未吸煙者DCs數(shù)量和CCR6含量和吸煙無COPD患者相比，差異并不顯著，這其中的原因可能是和本次研究選擇的樣本量較少，同時(shí)吸煙無COPD者吸煙指數(shù)相對(duì)較低等因素有關(guān)〔13，14〕。所以，無吸煙者和吸煙但無COPD的DCs數(shù)量和CCR6含量水平是否差異不顯著，值得臨床深入研究。

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