黃慶海，吳亞萌，李震，謝維

(“發(fā)育與疾病相關(guān)基因”教育部重點實驗室 東南大學(xué)生命科學(xué)研究院，江蘇 南京 210096)

編碼人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)的基因是人體最為復(fù)雜、多態(tài)性最高的遺傳系統(tǒng)，屬雙親共顯性遺傳，也是最早用于研究人群遺傳親緣關(guān)系的標(biāo)記物之一[1]。20世紀(jì)70年代初期，HLA血清型(低分辨率)即已被用于人群親緣關(guān)系研究，但由于HLA血清型屬表現(xiàn)型，分辨率低，不能完全反映群體遺傳關(guān)系。20世紀(jì)90年代以來，隨著HLA高分辨率分型技術(shù)中的相繼應(yīng)用，HLA基因型(高分辨率)分型技術(shù)越來越成熟，多樣性也越來越多。國際組織相容性工作組(The International Histocompatibility Working Group， IHWG)在第11屆[2]、12屆[3]、13屆[4]學(xué)術(shù)會議中專題報道了大量人群HLA基因型的分布特征，13屆(2001年)學(xué)術(shù)會議結(jié)束后，專門設(shè)立了人類學(xué)/人類遺傳多樣性專項，繼續(xù)采集人群HLA及其免疫分子的多樣性數(shù)據(jù)。再加上很多學(xué)者關(guān)注與HLA群體分布特征有關(guān)的骨髓捐獻(xiàn)庫分型、HLA與疾病相關(guān)性等研究，HLA基因型數(shù)據(jù)越來越多，可使用的分析數(shù)據(jù)也越來越豐富。盡管這些數(shù)據(jù)為人類學(xué)研究，特別是人口歷史、人群擴張途徑等提供了很好的資源，但卻未見利用如此大量的數(shù)據(jù)勾畫出全球人群間的親緣關(guān)系。有觀點認(rèn)為，HLA并不適合用于歷史基因組的研究[5]。我們收集了全球110個人群的HLA高分辨率配型數(shù)據(jù)，對所有數(shù)據(jù)的等位基因命名和統(tǒng)計方法進(jìn)行了歸一化處理，運用N- J法構(gòu)建了多種全球人群關(guān)系樹，證明HLA分子的多態(tài)性無論是在全球范圍還是在某一局部地區(qū)都能很好地用于分析人群的親緣關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集與處理

本研究收集了PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)、CNKI (China National Knowledge Infrastru-cture， www.cnki.net)和IHWG會議論文集[2- 4]中發(fā)表的、針對本地(非近期遷徙而來)不相關(guān)健康人群的高分辨率(配型在2節(jié)，舊命名系統(tǒng)的4位及以上)的HLA分型數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)，并且去除那些相似作者群體研究相同地區(qū)、相同民族人群的文獻(xiàn)。將這些人群數(shù)據(jù)構(gòu)建成本地VFP(Visual FoxPro， VFP)數(shù)據(jù)庫，后續(xù)所有的計算和編程都在VFP環(huán)境中執(zhí)行。本研究根據(jù)國際人類學(xué)研究慣例[6- 8]，將全球人群分為10個區(qū)域：撒哈拉沙漠以南非洲(sub- Saharan Africa， SSA)、北非(North Africa， NAF)、歐洲(Europe， EUR)、 西南亞(Southwest Asia， SWA)、 東北亞(Northeast Asia， NEA)、東南亞(Southeast Asia， SEA)、大洋洲(Oceania， OCE)、 澳大利亞(Australia， AUS)、北美洲(North America， NAM)和南美洲(South America， SAM)。

考慮到國際HLA命名系統(tǒng)在不斷更新，為方便數(shù)據(jù)間進(jìn)行相互比較，本研究將所有人群數(shù)據(jù)的等位基因均更新為最新的名稱(HLA ambiguity release version 3.13.0， www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html[9])，例如將HLA- A*010101替換為HLA- A*01∶01∶01。同樣為了便于數(shù)據(jù)比較，我們將HLA的分型精度定位為2節(jié)，將編碼抗原肽結(jié)合凹槽的HLA Ⅰ類基因的第2、第3外顯子相同的等位基因視為同一種等位基因，例如將HLA- A*01∶01∶01∶01， A*01∶01∶01， A*01∶01∶02， A*01∶04N， A*01∶22N等歸一為HLA- A*01∶01；將編碼抗原肽結(jié)合凹槽的HLA Ⅱ類基因的第3外顯子相同的等位基因視為同一等位基因，例如HLA- DRB1*01∶01包括HLA- DRB1*01∶01∶01， DRB1*01∶01∶02， DRB1*01∶50等。

為了提高數(shù)據(jù)小數(shù)的精度，以達(dá)到更為精確的比較效果，所有人群的等位基因頻率用公式1和公式2重新進(jìn)行計算：

n=Af’*2N

(1)

Af=n/2N

(2)

其中的n代表等位基因頻數(shù)，Af’代表原文中的等位基因頻率，Af代表重新計算出的等位基因頻率(下同)，N代表樣本個體數(shù)量。

對于那些用表現(xiàn)型頻率統(tǒng)計的文獻(xiàn)，根據(jù)Hardy- Weinberg平衡原理，用公式3將表現(xiàn)型頻率轉(zhuǎn)換為基因型頻率：

(3)

其中的Pf代表表型頻率。為達(dá)到更為穩(wěn)定的計算效果，本研究通過公式4將同一人群的HLA- A，- B， 和- DRB1座位的等位基因頻率合并成一個虛擬的、聯(lián)合的HLA- ABD座位的等位基因頻率：

AfABD=(AfA+AfB+AfDRB1)/3

(4)

其中AfABD代表聯(lián)合座位HLA- ABD的等位基因頻率，AfA、AfB和AfDRB1分別代表HLA- A，- B和- DRB1座位的等位基因頻率。

1.2 構(gòu)建人群關(guān)系樹

本研究選擇馬氏距離(亦稱為曼哈頓距離，Manhattan distance)[10- 11]計算人群間的遺傳距離，距離計算如公式5所示：

(5)

其中xi和yi分別代表第x個人群和第y個人群中的第i個等位基因頻率，M為參與比較的兩個人群共同擁有的等位基因數(shù)目。再選擇N- J法(neighbor- joining method)[12]，用MEGA5 (http://www.megasoftware.net/)[13]構(gòu)建人群關(guān)系樹。

本研究中不同地區(qū)的人群數(shù)量差異較大，最多的是東南亞地區(qū)，人群數(shù)量為33個，最少的是澳大利亞地區(qū)，人群數(shù)量僅為2個。為了分析不同地區(qū)的人群數(shù)量不同是否影響人群關(guān)系樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，我們在每個地區(qū)中隨機挑選了2個人群，構(gòu)建了10個地區(qū)20個人群的關(guān)系樹。為了更進(jìn)一步分析這種影響，更好地區(qū)分不同地區(qū)人群的親緣關(guān)系，本研究計算了各地區(qū)人群間的平均遺傳距離，再用平均遺傳距離重新構(gòu)建了10個地區(qū)人群間的關(guān)系樹。各地區(qū)人群間的平均遺傳距離如公式6所示：

(6)

其中M代表參與比較的某一地區(qū)人群的數(shù)量，N代表參與比較的另一地區(qū)人群的數(shù)量。Di，j代表參與比較的第一個地區(qū)的第i個人群與第二個地區(qū)的第j個人群間的遺傳距離。

為了便于與以往其他學(xué)者運用mtDNA、NRY、全基因組SNP或者其他分子標(biāo)記物對各地人群研究的結(jié)果進(jìn)行比較，作者以取自津巴布韋的紹納人(Shona)作為人群關(guān)系樹的根節(jié)點，根據(jù)人群的地理位置對一些人群在關(guān)系樹的分布進(jìn)行了相應(yīng)旋轉(zhuǎn)。

2 結(jié)果與分析

本研究收集了國內(nèi)、外用于人類學(xué)、民族學(xué)、骨髓庫配型以及疾病對照研究產(chǎn)生的HLA高分辨率配型數(shù)據(jù)，總計110個健康本地人群，分布于非洲、歐洲、亞洲、北美洲、南美洲以及大洋洲(太平洋島嶼和澳大利亞)。HLA- A、- B、- DRB1座位的樣本量分別為454 071、455 233和496 221個染色體，合并成聯(lián)合的HLA- ABD座位后代表1405 525個染色體。HLA- ABD由HLA- A、- B和- DRB1 三個座位合并而來，其攜帶了更為豐富、更為穩(wěn)定的遺傳信息，由此而構(gòu)建的人群關(guān)系也更為穩(wěn)定，更具代表性。因此，我們的結(jié)果與討論將主要針對HLA- ABD座位展開。

用聯(lián)合的HLA- ABD構(gòu)建的全球110個人群的關(guān)系樹顯示，各大區(qū)域內(nèi)的人群相互聚類，不同區(qū)域間的人群完全分離(圖1)。撒哈拉以南非洲人群聚于人群樹的根部，這與本研究選擇了津巴布韋人作為關(guān)系樹的根節(jié)點有關(guān)。美籍非洲人居于南部非洲人群的中部，喀麥隆人、南非共和國人更靠近關(guān)系樹的根部，西部非洲人群則與北非人群靠近。北非的3個人群與西亞人群聚為一大支，顯示出北非的阿拉伯人或者柏柏爾人(Berbers)與西亞的阿拉伯人在遺傳上有較高的相似性。歐洲人群將西南亞人群分為兩部分，一部分是向北非人群靠近的西亞人群，另一部分是與東亞人群靠近的南亞次大陸人群(印度人)；南歐人群與中/北/西歐人群在法國相匯，暗示了歐洲南北部人群的基因成分是沿地中海東西兩岸進(jìn)行交流的，這也與用全基因組的SNP分析歐洲人群的遺傳結(jié)構(gòu)的結(jié)果[14]相一致。北亞人群(本分析中主要指韓國人和日本人，也包括部分中國北方少數(shù)民族)盡管與東南亞人群聚為一大支，但更接近于中亞人群，暗示了東北亞人群與中亞人群有較多的基因交流。14個漢族人群聚為一支，并基本以由北向南的順序相鄰接，南方漢族人群與北方漢族人群在長江一帶相匯，該結(jié)果與早期的多個基因座位聯(lián)合研究的結(jié)果[15]相一致，再一次說明中國南北方人群的分界線是長江天塹，而不是作為中國南北方氣候分界線的秦嶺淮河一線。中國臺灣原住民(高山族和平埔族)與菲律賓人、巴布亞新幾內(nèi)亞人等聚類，該支與澳大利亞原住民比較靠近，顯示了作為南島語系的臺灣原住民的遺傳特征，以及與南太平洋島嶼人群的遺傳相似性。美洲印第安人群聚為一大支，該支又分為兩簇，一個是北美印第安人，另一支是南美印第安人，并且基本按由北向南的順序排列。

為了測試不同地區(qū)的人群數(shù)量不同是否影響人群關(guān)系樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，我們從各地理區(qū)域內(nèi)隨機挑選 2個共計20個人群構(gòu)建了新的人群樹。結(jié)果顯示，各區(qū)域內(nèi)的兩個人群聚為一支，各區(qū)域之間人群的毗鄰關(guān)系與前述110個人群的關(guān)系樹的總體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致(圖2)，說明不同地區(qū)人群數(shù)量的不平衡并不影響人群樹的總體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。為了更進(jìn)一步驗證這一結(jié)果，本研究用各地區(qū)間人群的平均遺傳距離構(gòu)建了10個區(qū)域的關(guān)系樹，仍然顯示出與前述兩種關(guān)系樹相一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，自人群關(guān)系樹的根部至頂部，分別是撒哈拉以南的非洲、北非、歐洲、西南亞、東北亞、東南亞、大洋洲、澳洲、北美洲和南美洲(圖3)。

3種方法構(gòu)建的人群樹都能穩(wěn)定展示出全球人群同樣的親緣關(guān)系，我們也用HLA- A、- B、- DRB1三個座位的等位基因頻率分別構(gòu)建了全球人群的關(guān)系樹，并且又用Cavalli- Sforza距離、修改后的Cavalli- Sforza距離、Nei的標(biāo)準(zhǔn)距離和Rogers- Wright距離等常用的另外4種遺傳距離算法[11]構(gòu)建了基于HLA- ABD等位基因頻率的全球人群關(guān)系樹。不同數(shù)據(jù)、不同算法構(gòu)建的人群樹均顯示了同樣的結(jié)果(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，并且與應(yīng)用全基因組SNP構(gòu)建的全球人群關(guān)系樹有著相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[16- 17]。說明作為常染色體1個片段的HLA基因能夠穩(wěn)定地顯示全球人群的親緣關(guān)系。

圖1用HLA-ABD等位基因頻率構(gòu)建的10地區(qū)110個人群的N-J樹

Fig1N-JTreeof110populationsfromthetengeographicbasedonallelefrequencyofcombinedHLA-ABD

圖2用HLA-ABD等位基因頻率構(gòu)建的10地區(qū)20個隨機人群的N-J樹

Fig2N-JTreeof20populationsselectedrandomlyfromeachofthetengeographicregionsbasedonallelefrequencyofcombinedHLA-ABD

圖3用各地區(qū)間平均遺傳距離構(gòu)建的10地區(qū)人群的N-J樹

Fig3N-JTreeofpopulationsfromthetengeographicpopulationgroupsusingtheaveragedistancesbetweenanytwogeographicregions

3 討 論

20多年來，如此大量的HLA配型數(shù)據(jù)為人們提供了很好的分析人群親緣關(guān)系的資源，但卻未見應(yīng)用該基因多態(tài)性構(gòu)建全球人群關(guān)系樹的報道。一般歸結(jié)于HLA與環(huán)境的選擇壓力、遺傳性或者病原性疾病的選擇壓力有關(guān)。在本研究中，美籍非洲人已經(jīng)在北美洲定居了300多年，但在人群關(guān)系樹中仍與非洲的喀麥隆人聚類，美籍歐洲人、美籍亞洲人也都與其遷出地的人群聚類，至少說明在短期內(nèi)，環(huán)境的壓力并不會對人群的HLA頻率分布特征產(chǎn)生影響，人群的HLA頻率分布特征是人群固有的遺傳特征。本研究也將一些病人的HLA等位基因頻率與正常健康人群的進(jìn)行了比較對照，結(jié)果各地的病人群體仍與各地的健康人聚類，而并非不同地區(qū)的同一類病人群體聚類(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。某一類病人在總?cè)巳褐兄徽家恍〔糠郑⑶夷切┡c疾病相關(guān)的某個座位的某一個或某幾個等位基因頻率的改變對人群的總體HLA頻率分布特征影響很小。本研究應(yīng)用HLA等位基因頻率構(gòu)建的人群關(guān)系樹與用中性無選擇壓力的分子標(biāo)記物—全基因組SNP構(gòu)建的關(guān)系樹有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[16- 17]和人群親緣關(guān)系，同樣證明HLA基因的多態(tài)性是各人群固有的遺傳特征，適合作為分子標(biāo)記物用于全球人群的親緣關(guān)系分析。

我們在數(shù)據(jù)整理和分析過程中發(fā)現(xiàn)，那些混合人群會對關(guān)系樹的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響，例如，很多研究發(fā)現(xiàn)瑞典的少數(shù)民族Sami[18- 20]存在亞洲基因成分，當(dāng)我們將Sami的數(shù)據(jù)并入研究時發(fā)現(xiàn)，Sami與芬蘭人、瑞典的非Sami人聚為一小支，該支脫離歐洲主支而向亞洲方向靠近，并且東北亞人群在關(guān)系樹中的位置也發(fā)生了變化，從而影響了對芬蘭人、瑞典的主要人群和東北亞人群的遺傳關(guān)系分析。表明這些混合人群將吸引他的幾種祖先人群相互靠近，從而打亂了關(guān)系樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，影響了對主要人群的遺傳分析。除了瑞典的Sami外，我們在研究過程也排除了阿留申群島人(excluded Aleuts)[21]、新西蘭的毛里人(Maori)[22]和復(fù)活節(jié)島人(Easter Islander)[23]的配型數(shù)據(jù)，因為原文明確表明取樣人群存在與近期遷入人群的混血成分。這種現(xiàn)象提醒我們，在進(jìn)行全球人群的數(shù)據(jù)分析時，應(yīng)當(dāng)非常仔細(xì)地甄別那些近期混合人群，注意這些人群對關(guān)系樹造成的影響。

20多年來，隨著HLA高分辨率配型方法的不斷改進(jìn)，統(tǒng)計方法也各不相同，特別是在用限制片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism， RFLP)配型時，有的文獻(xiàn)使用的是基因型頻率統(tǒng)計，有的文獻(xiàn)使用的是表現(xiàn)型頻率統(tǒng)計，這兩種統(tǒng)計方法的基本原理完全不同，需要通過Hardy- Weinberg平衡原理將表型頻率轉(zhuǎn)換成基因型頻率后才能進(jìn)行比較。另外，不同的文獻(xiàn)HLA配型的分辨率也不相同，需要對其歸一化后才能進(jìn)行統(tǒng)一比較。本研究以編碼PBR區(qū)域的基因多態(tài)性為基準(zhǔn)，將配型數(shù)據(jù)定為2節(jié)，例如，將HLA*02∶01∶01，HLA*02∶01∶02等等位基因的頻率并為HLA*02∶01的頻率統(tǒng)計。經(jīng)過數(shù)據(jù)重新處理和統(tǒng)計后，長達(dá)20多年的配型數(shù)據(jù)才能進(jìn)行相互比較，這也是多年來未能將如此豐富的人類學(xué)數(shù)據(jù)用于人類學(xué)研究和分析的主要原因。

經(jīng)過對等位基因名稱、統(tǒng)計方法等的標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化，出自不同實驗室、不同實驗方法、不同統(tǒng)計方法的HLA等位基因頻率數(shù)據(jù)可以進(jìn)行相互比較，并且構(gòu)建了完整清晰的人群關(guān)系樹，無論是在全球范圍內(nèi)還是在各個地理區(qū)域，根據(jù)關(guān)系樹都能很好地解釋和分析人群間的遺傳差異性和相似性，說明HLA基因的多態(tài)性也是一種高效的研究人類學(xué)的分子標(biāo)記物。

致謝上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院范麗安教授和劉祥箴同學(xué)對本研究給予了幫助。

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