孫萬里，周家華

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 肝膽外科，江蘇 南京 210009)

腫瘤患者的預(yù)后與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為提高患者生存率的主要障礙。有一種新的假說，在腫瘤細(xì)胞到達(dá)靶器官之前，預(yù)轉(zhuǎn)移小生境(the pre- metastatic niche)會釋放出一些腫瘤相關(guān)的可溶性因子，激活一些骨髓來源的細(xì)胞(bone marrow- derived cells，BMDCs)，這些細(xì)胞先于腫瘤細(xì)胞而到達(dá)靶器官，在那里營造一個適宜腫瘤細(xì)胞生存的微環(huán)境來迎接腫瘤細(xì)胞的到來[2]。Erler等[3]研究認(rèn)為，原發(fā)乳腺腫瘤釋放的、缺氧誘導(dǎo)的賴氨酸氧化酶(lysyl oxidase，LOX)可能是乳腺癌肺轉(zhuǎn)移中關(guān)鍵的可溶性因子。結(jié)腸癌釋放的環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase- 2，COX- 2)在結(jié)腸癌定向肝預(yù)轉(zhuǎn)移中可以招募腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞進(jìn)入預(yù)轉(zhuǎn)移位點，形成預(yù)轉(zhuǎn)移小生境[4]。

胰腺癌是常見的消化道腫瘤，患者死亡的主要原因是胰腺癌引起的轉(zhuǎn)移性疾病，最常見的轉(zhuǎn)移部位是肝臟[5]，但是，關(guān)于在肝轉(zhuǎn)移過程中胰腺癌通過分泌何種可溶性因子誘導(dǎo)BMDCs至預(yù)轉(zhuǎn)移小生境的研究甚少。我們在前期的研究中證明了組織蛋白酶D前體(組織蛋白酶D precursor，pCath- D)組織蛋白酶D(cathepsin D)是人胰腺癌分泌的促進(jìn)定向肝轉(zhuǎn)移的可溶性因子[6]。本單位實驗觀察了胰腺癌分泌的組織蛋白酶D對于CD11b+髓系來源細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

胰腺癌細(xì)胞株L3.6pl、L3.6pl- s以及Colo357由本單位實驗室保存。L3.6pl- s細(xì)胞是由組織蛋白酶D特異性sh- RNA重組慢病毒感染L3.6pl細(xì)胞后，組織蛋白酶D表達(dá)明顯下降的細(xì)胞株。Transwell小室(8 μm)購自美國Corning公司，基質(zhì)蛋白膠購自美國BD公司，超濾離心管(截留相對分子質(zhì)量10 000)購自德國Millipore公司?？故蠼M織蛋白酶D抗體、FITC- anti- CD11b購自美國Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、條件培養(yǎng)基的收集(conditioned media，CM)及細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的提取 L3.6pl、L3.6pl- s以及Colo357在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時棄去培養(yǎng)中基，用PBS輕柔沖洗4～5次后加入無血清、無酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集。細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的提取采取之前[6]的方法。

1.2.2 裸鼠胰腺癌原位瘤建立 具體實驗方法見文獻(xiàn)[7]。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測 種植原位瘤后第3、7天收集肝臟和骨髓的全血細(xì)胞，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，離心獲得細(xì)胞，按照1×106個·μg-1的濃度加入FITC- anti- CD11b避光冰上孵育30 min。PBS洗滌細(xì)胞2次，重懸于500 ml PBS中，上機(jī)檢測。

1.2.4 組織蛋白酶D表達(dá)的測定 蛋白質(zhì)印跡法檢測胰腺癌細(xì)胞系L3.6pl、L3.6pl- s以及Colo357細(xì)胞培養(yǎng)上清中組織蛋白酶D的表達(dá)。取3組細(xì)胞濃縮的分泌蛋白樣品，進(jìn)行聚丙烯酰胺(SDS- PAGE)凝膠電泳，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)并將膜封閉(封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST)，封閉結(jié)束后，加入適量的一抗組織蛋白酶D抗體(一抗用封閉液1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜。將膜與辣根過氧化物(HRP)結(jié)合的二抗(二抗用封閉液1∶3 000稀釋)，室溫下?lián)u蕩孵育1.5 h，然后用TBST充分洗膜，漂洗3次，每次5～10 min。將配置好的顯影液加到PVDF膜上，避光室溫放置1～2 min，稍瀝干顯影液，將膜置于保鮮膜上并將膜包好(盡量避免氣泡)。GAPDH作內(nèi)參。最后用Image J軟件分析其蛋白相對表達(dá)量。

1.2.5 CD11b+髓系來源細(xì)胞的分離培養(yǎng) 取3只健康的4～6周齡清潔級BALB/C小鼠，常規(guī)獲得骨髓的全血細(xì)胞后裂解紅細(xì)胞，離心獲得骨髓細(xì)胞， PBS離心洗滌細(xì)胞2次(800 r·min-1，5 min)。棄上清，以含有青鏈雙抗的少量PBS重懸，并與適量的熒光標(biāo)記的FITC- anti- CD11b抗體結(jié)合。避光冰上孵育30 min后，用流式細(xì)胞儀分選，以含15%胎牛血清的RPMI 1640接種至25 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，加入GM- CSF 50 ng·ml-1，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.6 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖水平 將CD11b+髓系來源細(xì)胞分別用含有L3.6pl- CM、Colo357- CM、L3.6pl- CM+抗組織蛋白酶 D、鼠組織蛋白酶D(10 ng·ml-1)、L3.6pl- s- CM的15%胎牛血清RPMI 1640重懸，對照組以單獨含有15%胎牛血清RPMI 1640重懸。調(diào)整細(xì)胞密度為10 000個·孔-1接種于96孔板中，每組設(shè)5個復(fù)孔。分別培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl的MTT后繼續(xù)置入培養(yǎng)箱4 h，去上清后加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)低速振蕩10 min使用酶標(biāo)儀檢測，以570 nm波長處的光吸收值代表細(xì)胞活力，每組實驗重復(fù)3次。

1.2.7 Transwell小室實驗 (1) CD11b+髓系來源細(xì)胞遷徙實驗:每個小室上室面(直徑8 μm)加入50 μl含10 ng·ml-1BSA的無血清RPMI 1640，37 ℃放置30 min，然后加入無血清CD11b+髓系來源細(xì)胞懸液100 μl(5×105個·ml-1)，將小室的上室面置入含有不同腫瘤上清的下室中，在37 ℃、5%CO2條件下孵育24 h。棉球擦盡上室表面細(xì)胞后用乙醇固定和0.2%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下觀察穿入膜內(nèi)細(xì)胞。(2) CD11b+的髓系來源細(xì)胞侵襲實驗:預(yù)先將基質(zhì)蛋白膠在4 ℃過夜，變成液態(tài)后加入無血清培養(yǎng)液配成基質(zhì)蛋白膠混合液(基質(zhì)蛋白膠∶培養(yǎng)基=1∶8)。在加入細(xì)胞懸液前，中間微孔膜表鋪被200 μl 基質(zhì)蛋白膠混合液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱4 h后吸盡成膠表面的液體，其余操作同細(xì)胞遷徙實驗。

1.2.8 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP- 2)蛋白表達(dá)的測定 蛋白質(zhì)印跡法檢測分別經(jīng)過L3.6pl- CM、Colo357- CM、L3.6pl- CM+抗組織蛋白酶D、鼠組織蛋白酶D(10 ng·ml-1)、L3.6pl- s- CM處理的CD11b+髓系來源細(xì)胞中MMP- 2的表達(dá)。按照常規(guī)方法，分組加入蛋白裂解液提取總蛋白，制備樣品進(jìn)行SDS- PAGE凝膠電泳，余具體方法同前。一抗MMP- 2抗體用封閉液稀釋(1∶400)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD11b+髓系來源細(xì)胞比例

L3.6pl荷瘤鼠第3天、第7天肝臟中CD11b+細(xì)胞比例(33.44%±0.029%、38.15%±0.017%)明顯高于Colo357荷瘤鼠肝臟中的細(xì)胞比例(5.19%±0.009 %，6.76%±0.013%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中組織蛋白酶D的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，L3.6pl- CM中組織蛋白酶D的表達(dá)明顯高于L3.6pl- s- CM和 Colo357- CM中的表達(dá)，見圖1。

與L3.6pl- CM和L3.6pl- s- CM比較，aP<0.05;與L3.6pl- s- CM比較，bP<0.05

圖1腫瘤細(xì)胞上清液組織蛋白酶D的表達(dá)A.腫瘤細(xì)胞上清液組織蛋白酶D電泳圖；B.腫瘤細(xì)胞上清液組織蛋白酶D半定量統(tǒng)計圖

Fig1TheexpressionofCathepsinDoftumorconditionedmedia

2.3 MTT檢測組織蛋白酶D對CD11b+髓系來源細(xì)胞增殖的影響

CathepsinD促進(jìn)CD11b+髓系細(xì)胞的增殖，含有重組鼠組織蛋白酶D(0.267±0.034)對細(xì)胞的增殖相比于在含有L3.6pl- s- CM組(0.158±0.012)、Colo357- CM組(0.153±0.005)明顯增加(P<0.05)，而添加了阻斷劑之后，則增殖明顯受到抑制(0.166±0.008)(P<0.05)。

2.4 Transwell小室實驗

Anti- 組織蛋白酶D抑制CD11b+髓系細(xì)胞的遷徙和侵襲。在遷徙實驗中，培養(yǎng)24 h后，含有重組鼠 組織蛋白酶D組遷徙到膜內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量(36.666±4.932)明顯高于L3.6pl- s- CM組(19.333±1.527)及Colo357- CM組(13.778±3.065)(P<0.05)，而在CathepsinD被阻斷后遷徙細(xì)胞數(shù)量明顯減少(26.333±3.511，P<0.05)。

在侵襲實驗中，培養(yǎng)24 h之后，含有重組鼠組織蛋白酶D組細(xì)胞侵襲進(jìn)入微孔膜的數(shù)量(19.333±4.725)明顯多于含有L3.6pl- s- CM組(9.778±3.055)和Colo357- CM組(4.333±1.154)(P<0.05)，而在組織蛋白酶D被阻斷后細(xì)胞侵襲數(shù)量(14.66±2.561)明顯減少(P<0.05)。

2.5 CD11b+髓系細(xì)胞中MMP- 2蛋白變化的表達(dá)

見圖2。

圖2CD11b+髓系細(xì)胞MMP- 2蛋白表達(dá)

Fig2TheexpressionofMMP- 2proteininCD11bpositivebonemarrowderivedcells

3 討 論

目前的研究表明，表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子受體- 1、CD11、CD34的造血祖細(xì)胞以及CD11b+的髓系來源細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞到達(dá)前就預(yù)先到在轉(zhuǎn)移位點形成了預(yù)轉(zhuǎn)移小生境[2]。在腫瘤目標(biāo)性轉(zhuǎn)移器官中，CD11b+細(xì)胞被大量招募[8]。CD11b+細(xì)胞可以通過多種方式、途徑促進(jìn)腫瘤的增長和轉(zhuǎn)移。研究者認(rèn)為，CD11b+髓系來源細(xì)胞的招募在預(yù)轉(zhuǎn)移小生境的形成中起到了主要的作用[9]。在本實驗中觀察到預(yù)轉(zhuǎn)移期內(nèi)L3.6pl原位移植瘤模型骨髓和肝臟中CD11b+髓系來源細(xì)胞的比例明顯增加，且明顯高于Colo357原位移植瘤模型骨髓和肝臟中此細(xì)胞的比例。這個結(jié)果表明,在胰腺癌肝轉(zhuǎn)移中大量的CD11b+髓系來源細(xì)胞被動員并招募到預(yù)轉(zhuǎn)移的器官，構(gòu)成預(yù)轉(zhuǎn)移小生境。

在體內(nèi)預(yù)轉(zhuǎn)移小生境的形成過程中，腫瘤分泌特殊的可溶性因子發(fā)揮著重要的作用。在先期研究中發(fā)現(xiàn)，p 組織蛋白酶D / 組織蛋白酶D是人胰腺癌分泌的促進(jìn)定向肝轉(zhuǎn)移的可溶性因子。本實驗也證明了人胰腺癌細(xì)胞株L3.6pl所分泌的組織蛋白酶D明顯高于人胰腺癌細(xì)胞株Colo357所分泌的組織蛋白酶D(見圖1)。組織蛋白酶D是一種廣泛存在于各種組織細(xì)胞中的一種溶酶體蛋白酶，其在許多腫瘤中表達(dá)增高，它不但可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增生，而且可以促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[10]。本研究探討胰腺癌分泌的可溶性因子組織蛋白酶D是否對CD11b+髓系來源細(xì)胞的體外生物學(xué)行為有影響。用流式細(xì)胞儀分選出小鼠骨髓中的CD11b+細(xì)胞用于體外培養(yǎng)并進(jìn)行下一步的研究。在MTT增殖實驗中看到，組織蛋白酶D對CD11b+髓系細(xì)胞的增殖具有很明顯的促進(jìn)作用，阻斷組織蛋白酶D后則促增殖的作用明顯受到抑制。通過流式分析儀可以觀察到，在裸鼠自身肝臟中含有著很少量的CD11b+的細(xì)胞，而荷瘤裸鼠肝臟中CD11b+的細(xì)胞明顯增多，預(yù)轉(zhuǎn)移小生境中的髓系細(xì)胞是由骨髓、外周血以及原發(fā)腫瘤中遷移而來的，而從后面的細(xì)胞增殖實驗的結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶D對于CD11b+髓系來源細(xì)胞有一定的促增殖作用，我們猜想預(yù)轉(zhuǎn)移小生境的髓系細(xì)胞的組成一部分是遷徙而來的，另一部分則是由遷徙來的骨髓細(xì)胞增殖而成的。這是我們后續(xù)關(guān)注的一個方面。骨髓細(xì)胞的遷徙是預(yù)轉(zhuǎn)移小生境形成的一個關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。本實驗以Transwell小室為模型，觀察組織蛋白酶D在CD11b+髓系來源細(xì)胞的遷徙實驗中發(fā)揮的作用，發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶D能夠顯著地提高CD11b+髓系來源細(xì)胞的遷徙能力，阻斷它后遷徙的細(xì)胞數(shù)量明顯下降，同樣也發(fā)現(xiàn)L3.6pl- CM對遷徙的影響大于單純含有組織蛋白酶D的影響。骨髓細(xì)胞是通過擴(kuò)增、遷徙和侵襲一步步地定植到預(yù)轉(zhuǎn)移器官。我們觀察到組織蛋白酶D對CD11b+髓系來源細(xì)胞侵襲能力是有影響的，同樣通過Transwell小室模型，我們觀察到組織蛋白酶D對CD11b+髓系來源細(xì)胞侵襲力有一定的促進(jìn)作用。Coussens等[11]認(rèn)為，BMDCs的侵襲力的增加與MMPs激活相關(guān)。通過蛋白質(zhì)印跡法觀察到，組織蛋白酶D對于CD11b+髓系來源細(xì)胞MMP- 2的激活有重要作用。Erler等通過研究發(fā)現(xiàn)，LOX可以增強(qiáng)CD11b+髓系來源細(xì)胞MMP- 2的活性，從側(cè)面證實MMP- 2在CD11b+髓系來源細(xì)胞的侵襲中發(fā)揮了一定的作用。組織蛋白酶D參與惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，目前主要認(rèn)為是其活性肽AP片段發(fā)揮著重要的作用。已有研究認(rèn)為，腫瘤以及免疫細(xì)胞產(chǎn)生一些在CD11b+髓系來源細(xì)胞的募集及擴(kuò)增中發(fā)揮著重要作用的因子，包括血管內(nèi)皮生長因子、COX、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM- CSF)、IL- 4和IL- 6。Deng等[12]認(rèn)為，髓系細(xì)胞中S1PR1- STAT3信號途徑在預(yù)轉(zhuǎn)移小生境的形成中發(fā)揮著重要的作用。但是組織蛋白酶D與髓系細(xì)胞中STAT3和JAK直接激活的相關(guān)性研究未見報道，也不清楚AP片段是否與其有關(guān)，故組織蛋白酶D是如何動員并遷徙CD11b+髓系來源細(xì)胞的機(jī)制還未闡釋清楚。

從上述實驗結(jié)果中觀察到，純化的組織蛋白酶D能獨立誘導(dǎo)CD11b+髓系來源細(xì)胞動員，但與L3.6pl- CM組的結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，其誘導(dǎo)CD11b+髓系來源細(xì)胞動員的能力低于L3.6pl- CM，可能的原因是L3.6pl- CM中蘊(yùn)含有其他的可溶性因子，同樣可以誘導(dǎo)CD11b+髓系來源細(xì)胞，或這些可溶性因子對組織蛋白酶D的誘導(dǎo)作用有協(xié)同效應(yīng)，能促進(jìn)組織蛋白酶D對CD11b+髓系來源細(xì)胞的動員。目前的研究中高轉(zhuǎn)移性的胰腺癌細(xì)胞系L3.6pl- CM中有很多的可溶性因子，包括有血管內(nèi)皮生長因子和COX，這在一定程度上解釋了L3.6pl- CM動員并遷徙CD11b+髓系來源細(xì)胞的能力強(qiáng)于單純的組織蛋白酶D的動員能力。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌肝轉(zhuǎn)移模型中CD11b+髓系來源細(xì)胞大量招募到肝臟中并參與形成預(yù)轉(zhuǎn)移小生境，體外實驗中組織蛋白酶D可以促進(jìn)CD11b+髓系來源細(xì)胞的增殖、遷徙，并且通過增強(qiáng)MMP- 2來促進(jìn)它的侵襲。本實驗僅僅是從體外實驗說明了組織蛋白酶D能動員CD11b+髓系來源細(xì)胞，而缺乏在體內(nèi)方面的研究，我們將在后續(xù)的實驗中對此進(jìn)一步完善明確。

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