張政偉 強(qiáng)曉菲 付建華 郭 利 王志勇

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

前列腺癌是中老年男性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是男性癌死亡的主要病因之一〔1〕。由于早期癥狀不明顯，診斷時患者歲數(shù)一般較大，并且容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后不良。因此探討前列腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制為提高診斷和預(yù)后至關(guān)重要。微小RNA(microRNA或miRNA)是一類內(nèi)源性的，非編碼單鏈RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)〔2,3〕。miRNA在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著作用〔4,5〕。研究表明miRNA的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切〔6〕，在腫瘤中扮演著腫瘤抑制基因或者癌基因的角色〔7〕。本研究檢測miR-20a在前列腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平，探討miR-20a對前列腺癌細(xì)胞生長和侵襲的影響，并尋找miR-20a的靶基因來闡述其發(fā)揮作用的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料和試劑 30對前列腺癌和正常組織來源于河北承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科。樣本得到病人的同意并通過病理學(xué)和免疫組化方法加以驗(yàn)證。miR-20a ASO和對照寡核苷酸以及含有ABL2 3'UTR的熒光報(bào)告載體均購自上海吉瑪生物技術(shù)公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000購自Invitrogen公司，組織和細(xì)胞miRNA提取試劑盒購自Qiagen公司，反轉(zhuǎn)錄酶購自Fermentas公司，實(shí)時定量PCR的SYBR Green Mix購自Takara公司。體外細(xì)胞侵襲的Transwell小室購自Millipore公司。兔抗人ABL2抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體以及羊抗兔的二抗均購自武漢三鷹公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 本實(shí)驗(yàn)涉及的所有細(xì)胞均用含有10%血清的培養(yǎng)液在5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)。正常前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-1)的培養(yǎng)基是角細(xì)胞無血清培養(yǎng)液(K-SFM)，并含有0.05 mg/ml BPE和5 ng/ml 表皮生長因子(EGF) 。前列腺癌細(xì)胞DU145、PC-3和LNCaP的培養(yǎng)基是RPMI 1640，而VCaP的培養(yǎng)基是DMEM。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前接種到6孔板或者48孔板，待第2天細(xì)胞密度達(dá)到80%時利用LipofectamineTM 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2RNA提取和實(shí)時定量PCR 組織和細(xì)胞中miRNA的提取根據(jù)miRNA提取試劑盒的說明進(jìn)行。提取的RNA利用NanoDrop ND-1000進(jìn)行濃度和質(zhì)量的測定。取500 ng RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，對于miRNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，利用miR-20a的特異性反轉(zhuǎn)錄引物。得到的cDNA產(chǎn)物稀釋5倍后取2 μl進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系是：cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl，2×SYBR Green Mix 10 μl，無菌蒸餾水6 μl。在ABI 7 300實(shí)時定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件是：95℃ 30 s，隨后進(jìn)行95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s 40個循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)以U6 RNA作為內(nèi)參檢測組織和細(xì)胞中miR-20a的表達(dá)水平。

1.2.3細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的前列腺癌細(xì)胞以200個細(xì)胞/孔的密度接種到12孔板，細(xì)胞培養(yǎng)液每隔3 d換1次，大概10 d，大部分細(xì)胞克隆含有超過50個細(xì)胞時，倒掉培養(yǎng)液用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞后，利用5%結(jié)晶紫進(jìn)行克隆染色，染色后在顯微鏡下拍照并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞消化后重懸在無血清培基中，接種到含有Matrigel的Transwell小室內(nèi)(2.5×104細(xì)胞)，小室外是含有10%血清的培養(yǎng)基。待細(xì)胞侵襲20 h，取出小室，用PBS清洗、4%甲醛固定、甲醇穿透后，將未穿過小室膜的細(xì)胞用棉簽擦去，穿過膜的細(xì)胞用5%結(jié)晶紫染色，最后在顯微鏡下拍照，隨機(jī)選擇細(xì)胞分布相對均勻的視野，計(jì)數(shù)平均每個視野下穿透的細(xì)胞數(shù)。

1.2.5Western 印跡實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，PBS清洗細(xì)胞，利用RIPA裂解液提取細(xì)胞的蛋白。用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白質(zhì)的濃度。取15 μg蛋白進(jìn)行十二烷基本硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，之后轉(zhuǎn)膜、封閉，用兔抗人的ABL2抗體室溫孵育2 h，Tis鹽酸緩沖液(TBST)洗膜，二抗用帶有辣根過氧化物酶的羊抗兔抗體室溫孵育1 h后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影，并分析條帶的強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)利用GAPDH作為內(nèi)參檢測ABL2的表達(dá)水平。

1.2.6生物信息學(xué)預(yù)測 本實(shí)驗(yàn)中，靶基因預(yù)測遵循以下原則：(1)靶基因預(yù)測軟件TargetScan、miRanda和microRNA.org預(yù)測的靶基因3'UTR含有miR-20a的結(jié)合位點(diǎn)；(2)候選靶基因的功能與miR-20a的作用相關(guān)；(3)靶基因在前列腺癌中是表達(dá)的。

1.2.7綠色熒光蛋白(GFP)熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞同時轉(zhuǎn)染miR-20a的ASO和含有ABL2 3'UTR的報(bào)告載體以及ASO的對照和ABL2 3'UTR的報(bào)告載體。轉(zhuǎn)染48 h后，PBS清洗細(xì)胞，利用RIPA裂解液提取細(xì)胞的蛋白。利用熒光測定儀器測定GFP的熒光強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染的同時轉(zhuǎn)染表達(dá)紅色熒光紅色熒光蛋白(RFP)的質(zhì)粒作為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)時熒光定量PCR檢測前列腺癌組織和細(xì)胞中miR-20a的表達(dá) 與正常組織相比，24例前列腺癌中miR-20a的表達(dá)水平升高。利用實(shí)時定量PCR檢測正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1和前列腺癌細(xì)胞中miR-20a的水平，結(jié)果顯示miR-20a在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)明顯升高(RWPE-1、LNCaP、PC-3、DU145、VCaP細(xì)胞miR-20a mRNA表達(dá)量分別為1.0、2.41、5.83、7.92、3.16，均P<0.05)。

2.2miR-20a對前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響 ASO組細(xì)胞內(nèi)miR-20a的表達(dá)水平較對照組降低約80%(PC細(xì)胞：0.14 vs 1.0；DU 125細(xì)胞：0.21 vs 1.0)(P<0.05)。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-20a ASO組的PC-3(86.48 vs 97.26)和DU145細(xì)胞(79.57 vs 88.93)克隆形成數(shù)較對照組降低約15%。Transwell小室實(shí)驗(yàn)，miR-20a ASO組細(xì)胞穿過膜的細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組(PC細(xì)胞：25.31 vs 60.24,DU145細(xì)胞：47.72 vs 112.38)減少約60%(P<0.05)。見圖1。

圖1 miR-20a對前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

2.3miR-20a靶定ABL2靶基因 遵循靶基因篩選原則，初步選擇ABL2作為miR-20a的候選靶基因，ABL2 3'UTR與miR-20a的結(jié)合位點(diǎn)。在細(xì)胞中同時轉(zhuǎn)染miR-20a ASO和ABL2 3'UTR，GFP熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)顯示，miR-20a ASO組中ABL2 3'UTR的熒光強(qiáng)度(PC-3細(xì)胞：1.32， DU125細(xì)胞：1.41)較對照組(1.0)增強(qiáng)(P<0.05)。但是，將結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)部分堿基進(jìn)行突變后，miR-20a ASO對突變的ABL2 3'UTR沒有影響(GFP熒光強(qiáng)度：PC-3細(xì)胞1.08，DU125細(xì)胞0.94，對照組為1.0)，說明ABL2是miR-20a的直接靶基因。而且,Western 印跡結(jié)果顯示，miR-20a ASO組細(xì)胞中ABL2的蛋白水平(PC-3、DU145、LNCaP、VCaP細(xì)胞分別為3.41、2.13、2.82、1.92)較對照組(1.0)升高，而過表達(dá)miR-20a的mimics組細(xì)胞中ABL2的表達(dá)水平(PC-3、DU145、LNCaP、VCaP細(xì)胞分別為0.21、0.32、0.47、0.58)降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-20a靶基因ABL2驗(yàn)證

2.4干擾ABL2表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞侵襲的影響 轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞中ABL2的水平降低約80%(對照組為1.0，PC-3細(xì)胞：0.18，DU145細(xì)胞：0.21)(P<0.05)。體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與siRNA對照組相比，ABL2 siRNA組的細(xì)胞穿過膜的細(xì)胞數(shù)升高約1.5或者2倍(PC-3細(xì)胞：siRNA對照組vs ABL2 siRNA組為61.12 vs 143.67;DU145細(xì)胞：siRNA對照組vs ABL2 siRNA組為43.23 vs 106.75)，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 RNA干擾ABL2表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞侵襲的影響

2.5補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-20a通過靶定ABL2調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的侵襲 ABL2 siRNA可以恢復(fù)由miR-20a ASO引起的ABL2水平的升高(圖4A，4B)；體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，ABL2 siRNA組中細(xì)胞穿膜數(shù)較對照組升高，說明ABL2 siRNA可以恢復(fù)由miR-20a ASO引起的細(xì)胞侵襲能力的降低(P<0.05)(見圖4C)。

圖4 補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-20a通過靶定ABL2調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的侵襲

3 討 論

miRNA作為基因表達(dá)中一類重要的調(diào)控因子，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。在本研究結(jié)果與其他研究中的發(fā)現(xiàn)一致，例如，miR-20a可以促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔8〕；miR-20a通過調(diào)控Fas基因的表達(dá)從而增加骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的能力〔9〕。miR-20a位于13號染色體，是miR-17-92基因簇的成員。該基因簇編碼6個miRNA，包括miR-17、miR-18a、miR-19a、 miR-20a、miR-19b和miR-92a〔10〕。該家族成員在大部分腫瘤中表達(dá)較高，發(fā)揮著癌基因的作用。

本研究中，生物信息學(xué)方法預(yù)測顯示ABL2是miR-20a的潛在靶基因。GFP熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染miR-20a ASO的細(xì)胞中miR-20a的表達(dá)降低后，ABL2 3'UTR的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，而將結(jié)合位點(diǎn)部分堿基突變后導(dǎo)致作用消失，同時Western 印跡實(shí)驗(yàn)也證實(shí)抑制miR-20a表達(dá)后，ABL2的蛋白水平降低，證實(shí)ABL2是miR-20a的直接靶基因。miR-20a通過作用于ABL2 3'UTR上的結(jié)合位點(diǎn)而抑制ABL2的表達(dá)水平。

ABL2，即非受體的酪氨酸激酶 Abelson相關(guān)基因，位于1號染色體，通過調(diào)控細(xì)胞骨架參與對細(xì)胞形態(tài)以及侵襲遷移能力的調(diào)控〔11〕。RAS的作用因子RIN1可以通過與ABL蛋白的SH2和SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而激活A(yù)BL2的催化活性，引起下游細(xì)胞骨架調(diào)控因子的磷酸化，在細(xì)胞黏附、侵襲和遷移過程中發(fā)揮著重要的作用〔12〕。這些研究表明ABL2參與對細(xì)胞侵襲行為的調(diào)控。本研究也得到了類似的結(jié)果，ABL2的表達(dá)敲降后，細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，并且可以恢復(fù)由miR-20a封閉所引起的細(xì)胞侵襲能力的降低，進(jìn)一步驗(yàn)證ABL2介導(dǎo)miR-20a對細(xì)胞侵襲行為的發(fā)揮。

綜上，miR-20a通過抑制ABL2的表而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的侵襲，發(fā)揮著癌基因的作用。因此，抑制miR-20a的表達(dá)有可能為以后前列腺癌的分子治療奠定理論基礎(chǔ)。雖然基因治療在臨床應(yīng)用上還有很大的障礙，但是癌癥發(fā)生過程關(guān)鍵分子的發(fā)現(xiàn)可以提供更多的依據(jù)和策略。

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