劉怡菲 褚昀赟 岑暢飛 劉先哲

(三峽大學人民醫(yī)院，湖北 宜昌 443002)

轉化生長因子β1(TGF-β1)作為強大的促纖維化細胞因子，與平滑肌細胞(SMCs)上受體結合活化胞內(nèi)Smad信號通路，刺激細胞外基質(ECM)合成〔1〕，增加動脈粥樣斑塊的穩(wěn)定性。Smad泛素調節(jié)因子2(Smurf2)是泛素連接酶E3 HECT家族成員，其能干擾TGF-β1細胞內(nèi)經(jīng)典的Smad信號轉導途徑中多個環(huán)節(jié)阻斷TGF-β1信號轉導〔2〕，從而減弱 TGF-β1纖維化作用。雖然Raines等〔3〕腎纖維化疾病中研究發(fā)現(xiàn)在腎小管上皮細胞中TGF-β1促進Smurf2基因和蛋白的表達水平，但在血管平滑肌細胞(VSMCs)中二者之間的關系尚未闡明。本實驗選擇以動脈粥樣硬化為背景，研究在VSMCs中TGF-β1對Smurf2的作用，探討不同濃度TGF-β1對Smurf2以及其后續(xù)產(chǎn)物ECM中Ⅰ型膠原(ColⅠ)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠VSMCs A7r5(中科院上海細胞庫)。低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FCS)(美國Gibco)，TGF-β1(廣州奕源生物科技有限公司)，胰蛋白酶-EDTA(武漢博士德生物工程有限公司)，反轉錄試劑盒(大連TAKARA公司)，GoTaq GreenMaster Mix(美國Promega),TRIzol(上海華舜)，Smurf2引物(上海生工生物工程技術服務有限公司)，兔抗大鼠Smurf2抗體(美國Santa Cruz公司),辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(北京中山公司)，大鼠ColⅠ ELISA試劑盒(上海藍基生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) A7r5用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5% 二氧化碳(CO2)恒溫條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用于試驗。隨機分為：對照組(不含干預因素的正常培養(yǎng)的細胞)、TGF-β1(1、5、10 μg/L)3種濃度分別刺激24 h，每組均為4瓶細胞。

1.2.2RT-PCR法檢測A7R5細胞中Smurf2 mRNA的表達量 根據(jù) Trizol RNA說明書提取細胞總RNA。根據(jù)GenBank內(nèi)的序列，采用Primer Premier5.0設計引物，序列如下：Smurf 2引物：正鏈 5′-GGG AAC GCC CAA CAA GAC-3′，反鏈 5′-ATT GCG GAT CTC CCA CCC-3′，368 bp；β-actin正鏈：5′-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3′，反鏈：5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′，375 bp，逆轉錄條件按說明書操作即可。PCR擴增條件：94℃預變性5 min、94℃變性35 s、56℃復性35 s，72℃延伸45 s條件擴增30次。72℃補充延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以1 000 bp DNA梯度標記上樣作為分子量標記；以UVP凝膠圖像掃描系統(tǒng)測目的基因與β-actin吸光度A比值，設對照組為1，試驗重復3次。

1.2.3Western印跡檢測Smurf2蛋白的表達 用4℃預冷的PBS洗細胞3次，加入300 μl含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解緩沖液，置于冰上30 min，收刮細胞，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA法測蛋白質濃度。各組取50 μg待測蛋白質樣本，與蛋白質分子量標準品共同進行SDS-PAGE電泳，聚丙酰胺的積層膠濃度為5%，分離膠濃度為8%，將蛋白質轉移至PVDF膜上，置5%脫脂奶粉封閉緩沖液中37℃ 60 min，TBS漂洗后分別加入兔抗大鼠Smurf 2抗體(1∶500)，4℃過夜用TBS漂洗，充分洗膜后與辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗(1∶3 000)37℃ 60 min，然后用TBS漂洗，ECL法顯色，X光膠片曝光顯影。試驗重復3次。

1.2.4ELISA測細胞培養(yǎng)物上清中ColⅠ的表達 提取細胞上清液，10 000 r/min離心10 min除顆粒和聚合物，將標本放于-20℃或-80℃保存，用ELISA定量測定ColⅠ的濃度,按說明書操作即可。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1TGF-β1對大鼠VSMCs Smurf2 mRNA水平的影響 對照組有一定量的Smurf2 mRNA表達(0.264 8±0.008 74)，用TGF-β1(1、5、10 μg/L)分別刺激大鼠VSMCs 24 h后， Smurf2 mRNA的表達明顯減弱(0.240 5±0.009 42、0.180 8±0.014 83、0.131 4±0.007 43)，分別下降9.177%、31.722%和50.378%，且呈劑量依賴性，與對照組比較有顯著差異(P<0.05)，見圖1。

1：對照組； 2：TGF-β1(1 μg/L)； 3：TGF-β1(5 μg/L)； 4：TGF-β1(10 μg/L)，下圖同

2.2TGF-β1對大鼠VSMCs Smurf2蛋白表達的影響 對照組有一定量的Smurf2蛋白表達，用TGF-β1(1、5、10 μg/L)刺激大鼠VSMCs 24 h后， Smurf2蛋白的表達均明顯降低，與對照組比較，分別下降了14.78%、18.63%和35.28%(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見圖2。

圖2 不同濃度TGF-β1作用下Smurf2和內(nèi)參蛋白免疫印跡結果

2.3TGF-β對大鼠VSMCs ColⅠ表達的影響 不同濃度TGF-β1作用于大鼠VSMCs 24 h后，ELISA檢測細胞上清液中ColⅠ蛋白的表達量發(fā)現(xiàn)：同對照組相比，不同濃度TGF-β1作用下ColⅠ蛋白表達量均升高，分別是對照組的1.276 8、121.448 5和1.635 5倍(P<0.01)，見圖3。

圖3 Ⅰ型膠原標準曲線

3 討 論

既往的研究表明VSMC，是動脈粥樣硬化斑塊中最主要的細胞成分，各種生長因子對VSMC，轉型、增殖的調節(jié)已成為動脈粥樣硬化發(fā)病機制研究的熱點〔4〕。Stefroni等〔4〕通過做血透發(fā)現(xiàn)伴有冠心病的患者血中TGF-β1水平明顯低于無冠心病的患者，血TGF-β1水平每降低1 μg/L，心血管疾病相關威脅性增加9%，表明TGF-β1水平降低是導致動脈粥樣硬化的獨立威脅因子。進一步研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1是強大的催纖維化因子，可刺激VSMCs產(chǎn)生ECM，增加纖維帽厚度〔1〕。這些研究結論與本研究結果是一致的。

Smurf2是C2-WW-HECT 結構域的E3 泛素連接酶家族的一員，在多種生物過程中扮演重要角色。Smurf2能干擾TGF-β1信號轉導途徑的多個重要環(huán)節(jié)阻斷其信號轉導〔5〕。高表達的Smurf2能降低TGF-βRI的表達水平〔6〕，最近研究表明TGF-βRⅡ也可以被Smurf2降解〔7〕。Smurf2能與Smad 2的脯-酪氨酸(PPXY)序列緊密結合,通過HECT結構域催化降解Smad 2。雖然Smad4分子的序列中沒有PPXY模序,當Smurf2與I-Smad共同存在時,Smad 4與Smad 7通過各自的MH2區(qū)相結合,由Smad7介導其多泛素化而降解〔8～12〕。Smurf2通過對TGF-β1胞內(nèi)Smad通路精細復雜地調節(jié)影響其細胞外基質的合成，在維持動脈粥樣斑塊的穩(wěn)定性中起重要作用。

本研究結果顯示TGF-β1可抑制VSMCs中Smurf2的表達，促進ColⅠ的表達。TGF-β1作為動脈粥樣硬化中的保護因子，隨濃度的升高逐漸促進ColⅠ的產(chǎn)生，與以往文獻報道相符〔1，13〕，并隨濃度依賴性抑制Smurf2表達，由此推斷在VSMCs中，TGF-β1提高其信號強度，增加ECM的產(chǎn)生，抑制Smurf2的表達可能是其作用機制的一種。

4 參考文獻

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