李 磊，張英楠，楊樹寶，馮小剛，劉 瑩，董紅艷，馬金萍，欒維民，4

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118; 2吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)展學(xué)院，吉林長春 130600;3吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130118; 4吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130118)

雞嗉囊中淋巴細(xì)胞發(fā)育的研究

李 磊1，張英楠2，3，楊樹寶1，馮小剛1，劉 瑩1，董紅艷1，馬金萍1，欒維民1，4

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118; 2吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)展學(xué)院，吉林長春 130600;3吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130118; 4吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130118)

【目的】研究雞出殼后不同日齡嗉囊中T淋巴細(xì)胞及其亞群和B淋巴細(xì)胞的定位分布及數(shù)量變化規(guī)律等一系列的發(fā)育過程.【方法】采用單克隆抗體，通過免疫組織化學(xué)方法，觀察并統(tǒng)計(jì)各取材日齡相應(yīng)細(xì)胞的分布和數(shù)量.【結(jié)果和結(jié)論】1日齡時(shí)，CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞即已出現(xiàn)，Bu-1b+細(xì)胞于出殼后4日齡時(shí)出現(xiàn).定位分布上，CD3+細(xì)胞主要分布于黏膜上皮基底層及固有層中，7日齡首次出現(xiàn)以CD3+細(xì)胞為中心的淋巴聚集物;CD4+細(xì)胞主要分布于固有層中;CD8+細(xì)胞最初主要分布在黏膜固有層中，隨日齡增長逐漸向上皮方向突入，最終形成含有CD8+細(xì)胞浸潤的淋巴上皮;Bu-1b+細(xì)胞主要分布于黏膜固有層中，特別是在小血管周圍.于35日齡觀察到以Bu-1b+細(xì)胞為中心的生發(fā)中心.在數(shù)量變化上，CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)量整體呈逐漸增加趨勢，部分陽性細(xì)胞數(shù)量在14和21日齡時(shí)稍有下降，35～56日齡時(shí)陽性細(xì)胞數(shù)量緩慢增加，基本達(dá)到成熟水平.Bu-1b+細(xì)胞數(shù)量隨著日齡的增加持續(xù)增多，且后期的增長速率大于T細(xì)胞的增長速率.結(jié)果表明，嗉囊作為雞消化系統(tǒng)的一部分，具有由淋巴細(xì)胞和淋巴聚集物構(gòu)成的免疫防線，為腸相關(guān)淋巴組織中的一個(gè)重要組成部分.

嗉囊;發(fā)育;定位分布;腸相關(guān)淋巴組織

隨著雞黏膜免疫研究的深入，雞黏膜免疫組織學(xué)內(nèi)容亦趨完善.大量研究表明，禽類腸相關(guān)淋巴組織由腸道中集合的淋巴組織和散在的淋巴細(xì)胞一起構(gòu)成.前者包括食管扁桃體、幽門扁桃體、盲腸扁桃體等，后者則為分布在各腸段中的散在的淋巴細(xì)胞，其主要分布于消化道、前胃、回腸和直腸等組織中［1-3］.嗉囊作為食物的最初儲(chǔ)存場所，能使禽類攝取的食物保持適當(dāng)?shù)臏囟群蜐穸?，并對其進(jìn)行浸潤與軟化，利于胃腸道對食物進(jìn)一步消化吸收.試驗(yàn)表明，切除嗉囊后雞消化能力明顯下降，并且更容易出現(xiàn)細(xì)菌感染等疾病，提示嗉囊對于食物中的微生物具有初步的抵御作用［4-5］.

馮小剛等［6］于2013年通過免疫組織學(xué)方法發(fā)現(xiàn)雞嗉囊中亦有大量的淋巴細(xì)胞分布，并將其歸為腸相關(guān)淋巴組織中的重要組成部分.鑒于此，本試驗(yàn)對雞嗉囊的淋巴細(xì)胞做進(jìn)一步研究.旨在觀察雞嗉囊中淋巴細(xì)胞的定位分布及數(shù)量變化情況，探索嗉囊免疫基礎(chǔ)的建立過程，從而為腸相關(guān)淋巴組織的完善增添新的內(nèi)容，同時(shí)也為疫苗的研發(fā)和嗉囊疾病的治療提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

將100枚清潔級海藍(lán)白種蛋進(jìn)行孵化，雞出殼后置于動(dòng)物室中常規(guī)飼養(yǎng).分別在出殼后1、4、7、14、21、27、35及56日取材.每次取7只雞新鮮嗉囊的相同部位，置于蛋白包埋液(OCT)中包埋后進(jìn)行低溫切片，片厚5 μm.-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?

1.2 抗體

試驗(yàn)所用單克隆抗體見表1.

表1 試驗(yàn)使用的單克隆抗體Tab.1 Monoclonal antibodies used in this experiment

1.3 試劑和儀器

日本櫻花蛋白包埋劑(OCT)，AAF液，丙酮，伊紅和3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(APES)等.Leica CM1850冰凍切片機(jī)，UltraSensitiveTM SP超敏試劑盒kit-9710(福州邁新公司)，Olympus CX41顯微鏡，Image-pro Plus 5.1圖像分析軟件(美國 Media Cybernetics公司)，Pixera pro150ES圖像采集器.

1.4 試驗(yàn)方法

取嗉囊切片做以下處理：滴加過氧化物酶阻斷溶液(試劑A)，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性;PBS洗3次，各3 min;滴加正常非免疫動(dòng)物血清(試劑B)封閉，室溫下孵育10 min;滴加相應(yīng)稀釋單抗工作液50 μL，4℃條件過夜;PBS洗3次，各3 min;滴加生物素標(biāo)記的第二抗體(試劑C)，室溫孵育10 min;PBS洗3次，各3 min;滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10 min;PBS洗3次，各3 min;DAB顯色;蘇木精復(fù)染;脫水;透明;鏡檢封片、照相.

1.5 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對各抗體陽性細(xì)胞進(jìn)行分析，并選擇放大倍數(shù)為100的圖片，采用Image-pro Plus 5.1圖像分析軟件對單位視野內(nèi)的免疫組織化學(xué)陽性細(xì)胞的面積進(jìn)行測定.對每個(gè)抗體對應(yīng)的各個(gè)部位的切片隨機(jī)選定5個(gè)視野，然后求平均值.采用SPSS19.0單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 CD3+細(xì)胞的發(fā)育規(guī)律

出殼后1日齡時(shí)，可見少量CD3+細(xì)胞分布于嗉囊黏膜固有層的小血管周圍(圖1a);4日齡時(shí)，CD3+細(xì)胞數(shù)量增多，散布于黏膜固有層與黏膜下層;7日齡時(shí)，首次觀察到以T細(xì)胞為中心的淋巴聚集物(圖1b)，且有部分CD3+細(xì)胞分布于沿黏膜上皮下區(qū)域;27日齡時(shí)，部分CD3+細(xì)胞出現(xiàn)在腺體周圍，并向腺體上皮突入;35日齡時(shí)，CD3+細(xì)胞出現(xiàn)在黏膜上皮中，形成嵌有淋巴細(xì)胞的黏膜上皮，同時(shí)，腺體與上皮間固有層中出現(xiàn)彌散的淋巴聚集物(圖1c).56日齡時(shí)，血管周圍陽性細(xì)胞較少，但淋巴聚集物增多，黏液腺上皮受淋巴細(xì)胞浸潤明顯，且部分腺體上皮和黏膜上皮轉(zhuǎn)化為淋巴上皮(圖1d).

CD3+細(xì)胞于1日齡時(shí)即出現(xiàn)，隨后于4日齡明顯增多(P＜0.05)，其后逐漸增多，并于21日齡時(shí)再次明顯增多(P＜0.05)，隨后CD3+細(xì)胞增加緩慢，呈較穩(wěn)定水平(圖2).

2.2 CD4+細(xì)胞的發(fā)育規(guī)律

1日齡時(shí)，少量的CD4+細(xì)胞出現(xiàn)在嗉囊固有層的血管周圍(圖1e);4日齡時(shí)，固有層中的CD4+細(xì)胞數(shù)量明顯增多;7日齡時(shí)，觀察到CD4+細(xì)胞出現(xiàn)在食管腺周圍，并有向腺體內(nèi)部突入趨勢(同CD3+細(xì)胞一樣，首次觀察到含CD4+細(xì)胞的淋巴聚集物); 21日齡時(shí)，CD4+細(xì)胞于濾泡間區(qū)域聚集，并發(fā)生明顯浸潤至腺體的現(xiàn)象;35日齡時(shí)，分布于聚集物的CD4+細(xì)胞，一部分位于濾泡外區(qū)域，而另一部分依然位于聚集物中心(圖1f、1g);56日齡時(shí)，部分CD4+細(xì)胞圍繞在腺體周圍，使部分腺體上皮轉(zhuǎn)化為淋巴上皮(圖1h).

CD4+細(xì)胞于1日齡能夠被觀察到，4日齡時(shí)增加明顯(P＜0.05)，隨后小幅上升，并于21日齡時(shí)再次顯著升高(P＜0.05)，之后數(shù)量逐漸趨于穩(wěn)定水平(圖2).

2.3 CD8+細(xì)胞的發(fā)育規(guī)律

1日齡時(shí)，單個(gè)CD8+細(xì)胞出現(xiàn)在嗉囊黏膜固有層和肌層中，偶在上皮基底層見單個(gè)陽性細(xì)胞分布; 4日齡時(shí)，多數(shù)散在的CD8+細(xì)胞圍繞在固有層的小血管周圍(圖1i)，上皮基底層可見單個(gè)陽性細(xì)胞浸潤;14日齡時(shí)，CD8+細(xì)胞逐漸向上皮內(nèi)遷移(圖1j);27日齡時(shí)，固有層中的陽性細(xì)胞多聚集在血管周圍、腺體與上皮間區(qū)域;35日齡時(shí)，浸潤上皮基底層的陽性細(xì)胞增多(圖1k);56日齡時(shí)，部分黏膜上皮和腺體上皮被CD8+細(xì)胞浸潤，使其轉(zhuǎn)化為淋巴上皮.在彌散淋巴組織中也有豐富的CD8+細(xì)胞聚集，而固有層中的陽性細(xì)胞分布漸少(圖1l).

CD8+細(xì)胞數(shù)量在4、14日齡時(shí)顯著增加(P＜0.05);而在21日齡時(shí)有所減少，但不顯著(P＞0.05);27日齡時(shí)，CD8+細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P＜0.05);35至56日齡，CD8+細(xì)胞數(shù)量逐步增加，但變化不顯著(P＞0.05)(圖2).

2.4 Bu-1b+細(xì)胞的發(fā)育規(guī)律

4日齡時(shí)，極少數(shù)的Bu-1b+細(xì)胞出現(xiàn)在嗉囊黏膜固有層中;7日齡時(shí)，在固有層小血管周圍、腺體與上皮間固有層中發(fā)現(xiàn)少數(shù)的Bu-1b+細(xì)胞(圖1m)，此時(shí)Bu-1b+細(xì)胞在其他部位分布仍極少;14日齡時(shí)，Bu-1b+細(xì)胞的分布較之前日齡分布更廣，散在分布于固有層中;27日齡時(shí)，Bu-1b+細(xì)胞初步形成聚集區(qū)，但上皮并未出現(xiàn)陽性細(xì)胞浸潤;35日齡時(shí)，出現(xiàn)了以Bu-1b+細(xì)胞為中心的淋巴聚集物和大量散在的陽性淋巴細(xì)胞，上皮也出現(xiàn)少量Bu-1b+細(xì)胞浸潤(圖1n);56日齡時(shí)，Bu-1b+細(xì)胞以散在的和聚集的形式大量分布于上皮下的固有層中，但上皮浸潤依舊僅發(fā)生在聚集物和腺體上方的上皮基底層中(圖1o).

4～21日齡，Bu-1b+細(xì)胞的數(shù)量呈增長趨勢，但并不顯著(P＞0.05);27日齡時(shí)，Bu-1b+細(xì)胞數(shù)量急速增長(P＜0.05);35日齡時(shí)，Bu-1b+細(xì)胞的數(shù)量也顯著增加(P＜0.05);與35日齡相比，56日齡時(shí)，Bu-1b+細(xì)胞的數(shù)量有所上升，但不顯著(P＞0.05)(圖2).

圖1 不同日齡時(shí)雞嗉囊中T淋巴細(xì)胞亞群和B淋巴細(xì)胞的分布情況Fig.1 The distribution of T lymphocyte subpopulations and B lymphocytes in crop of different day-old chickens

圖2 雞嗉囊中T淋巴細(xì)胞及其亞群、B淋巴細(xì)胞的發(fā)育變化Fig.2 Ontogenetic changes of T lymphocyte subsets and B lymphocytes in the chicken crop

3 討論與結(jié)論

腸相關(guān)淋巴組織同呼吸道相關(guān)淋巴組織、生殖道相關(guān)淋巴組織一起構(gòu)成了禽類體內(nèi)共同黏膜免疫的防御系統(tǒng).根據(jù)Castelyn等［7］報(bào)道，雞腸相關(guān)淋巴組織由食管扁桃體、幽門扁桃體、回腸派氏結(jié)及盲腸扁桃體等腸道集合淋巴組織以及散在于食管、腺胃、十二指腸、回腸及泄殖腔等組織中的淋巴細(xì)胞共同組成.然而，嗉囊作為雞食管的一個(gè)重要組成部分，時(shí)刻受到夾雜于食物中大量的物理性、生物病原體的侵?jǐn)_.馮小剛等［6］發(fā)現(xiàn)雞嗉囊中亦有大量淋巴細(xì)胞分布，并將其劃歸為腸相關(guān)淋巴組織中的一個(gè)不可缺少的部分.基于此，本研究結(jié)合禽類免疫學(xué)與發(fā)育學(xué)，通過免疫組織化學(xué)方法觀察雞嗉囊免疫活性細(xì)胞發(fā)育的日齡相關(guān)性變化，闡述B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及其亞群的分布，遷移定位和數(shù)量變化情況.

本研究發(fā)現(xiàn)，1日齡時(shí)，CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞即已出現(xiàn)，Bu-1b+淋巴細(xì)胞于出殼后4日齡時(shí)出現(xiàn).定位分布上，CD3+細(xì)胞主要分布于黏膜上皮基底層及固有層中，以CD3+細(xì)胞為中心的淋巴聚集物首次出現(xiàn)在7日齡;CD4+細(xì)胞主要分布于固有層中;CD8+細(xì)胞最初主要分布在黏膜固有層中，隨日齡增長逐漸向上皮方向突入，最終形成淋巴上皮; Bu-1b+細(xì)胞主要分布于黏膜固有層中，特別是在小血管周圍.35日齡時(shí)，觀察到以Bu-1b+細(xì)胞為中心的生發(fā)中心.并且CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)量于4日齡開始顯著持續(xù)增加，這與Friedman等［8］報(bào)道的法氏囊與胸腺T淋巴細(xì)胞在4日齡時(shí)發(fā)生第2次遷移至腸道的結(jié)果相一致，表明此時(shí)T淋巴細(xì)胞已經(jīng)發(fā)育成熟.而在14日齡(CD3+和CD4+細(xì)胞)和21日齡(CD8+細(xì)胞)時(shí)陽性細(xì)胞數(shù)量略有下降，這與欒維民等［9-10］及楊樹寶等［11］對食管扁桃體、盲腸扁桃體等發(fā)育研究結(jié)果基本一致.此外本研究還發(fā)現(xiàn)，在嗉囊中存在由淋巴細(xì)胞浸潤而轉(zhuǎn)化成的淋巴上皮，主要包括部分黏膜淋巴上皮和腺上皮，分析其可能與嗉囊特有的腔狀結(jié)構(gòu)有關(guān).嗉囊為雞飽腹后的儲(chǔ)食場所，時(shí)刻受到來自食物中的大量病原體的侵?jǐn)_，所以要求其在潤濕食物的基礎(chǔ)上同時(shí)能夠抵御食源性抗原的不利影響.由CD3+、CD8+細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)化而成的黏膜淋巴上皮能夠抵御來自腔內(nèi)的部分細(xì)菌及病原體的侵?jǐn)_，逃過此屏障進(jìn)一步浸入黏膜的微生物則會(huì)遭遇腺上皮轉(zhuǎn)化而來的淋巴上皮的再次抵制，誘發(fā)局部黏膜免疫.

本試驗(yàn)中雖未見大量淋巴生發(fā)中心的出現(xiàn)，但的確有較多的淋巴聚集物存在，同時(shí)Bu-1b+細(xì)胞的數(shù)量隨著日齡增長呈上升趨勢，這與之前的報(bào)道有所差異［12］.試驗(yàn)證明，生發(fā)中心的出現(xiàn)與病原體侵染相關(guān)，表現(xiàn)為黏膜受到外界刺激時(shí)，黏膜內(nèi)B淋巴細(xì)胞受到刺激后，局部代謝增強(qiáng)，細(xì)胞快速增殖，形成生發(fā)中心，進(jìn)而引起免疫應(yīng)答.本研究中，可能由于飼養(yǎng)環(huán)境單一，試驗(yàn)雞未接觸大量流行病原體，故不能引起大量的生發(fā)中心產(chǎn)生.同時(shí)，也可能與消化道免疫的基礎(chǔ)有關(guān).有研究報(bào)道，雞消化道中免疫系統(tǒng)早期以T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)為主，其細(xì)胞數(shù)量增長趨勢遠(yuǎn)大于B淋巴細(xì)胞.而到6周齡后，B淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著增加并大于T淋巴細(xì)胞數(shù)量，表現(xiàn)為以B淋巴細(xì)胞免疫為主，這亦可能是早期未見大量生發(fā)中心，而Bu-1b+細(xì)胞卻一直增加的原因［12-14］.有趣的是，本試驗(yàn)在雞出殼后7～56日齡間均能觀察到以T淋巴細(xì)胞為中心，而B淋巴細(xì)胞圍繞在周圍的獨(dú)特淋巴聚集物.通過對比前人的研究結(jié)果，在腸道中僅有腺胃和法氏囊中出現(xiàn)了此種情況［15-16］，而本試驗(yàn)的研究對象嗉囊，同前胃一樣為消化道中僅有的擁有較大直徑的空腔狀器官，這可能是出現(xiàn)共同結(jié)果的一個(gè)原因，但具體分布原因尚需進(jìn)一步深入研究.

本試驗(yàn)結(jié)果表明，嗉囊不僅是雞儲(chǔ)存食物的第一場所，亦具有腸黏膜免疫的基礎(chǔ)——即由淋巴細(xì)胞和淋巴聚集物構(gòu)成的免疫防線.同時(shí)，嗉囊淋巴細(xì)胞的遷移規(guī)律和分布情況，同其他腸組織淋巴細(xì)胞遷移和定位情況相一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了嗉囊可能是腸相關(guān)淋巴組織中的一個(gè)重要組成部分.同時(shí)，本試驗(yàn)描述了嗉囊淋巴細(xì)胞的發(fā)育情況，分析了嗉囊免疫系統(tǒng)的建立和發(fā)生，為治療嗉囊病以及雞疫苗的研發(fā)，進(jìn)行實(shí)時(shí)性免疫提供理論依據(jù).

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【責(zé)任編輯 柴 焰】

A study on development of lymphocytes in the chicken crop

LI Lei1，ZHANG Yingnan2，3，YANG Shubao1，F(xiàn)ENG Xiaogang1，LIU Ying1，DONG Hongyan1，MA Jinping1，LUAN Weimin1，4
(1 College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China; 2 College of Development，Jilin Agricultural University，Changchun 130600，China; 3 College of Life Science，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China; 4 Key Laboratory of Animal Production＆Product Quality and Security，Ministry of Education，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China)

【Objective】To study the appearance，distribution and quantity variation of immunocytes—T lymphocytes and its subpopulations and B lymphocytes in different periods，analyzing the developmental process of immunocytes in the chicken crop.【Method】The mono-antibodies and immunohistochemistry was used to observe the distribution and count the number of the relevant cell in every age.【Result and conclusion】The results showed that CD3+，CD4+and CD8+cells appeared in the first day after post-hatching.Bu-1b+cells were observed in the 4rh day.CD3+cells mainly distributed in the epithelium and lamina propria，and the lymphoid aggregates covered by CD3+cells were first observed in the 7th day after post-hatching.CD4+cells were located in the lamina propria.At first，CD8+cells mainly distributed in the lamina propria of the mucosa.With the age increasing，CD8+cells slightly migrated and infiltrated to the epithelium of the mucosa，which were transformed to the lymphoepithelium.Bu-1b+cells mainly distributed in the lamina propria，especially around the vessels.The germinal center which was covered by the Bu-1a+cells was first observed in the 35th day after post-hatching.The amount of CD3+，CD4+，and CD8+cells kept increasing with the age;the amount of parts of positive cells decreased in the 14th and 21th day;it slightly increased after this date and reached mature level around the 56th day.Bu-1b+cells continuously kept increasing with age，its rising rate was higher than T lymphocytes during the later period.The research showed that as a part of the digest system in the chicken，the crop posses ses the mucosal immunity which consists of the lymphoid aggregates and the lymphocytes.The crop is an important part of gut-associated lymphoid tissue(GALT).

crop;development;location and distribution;gut-associated lymphoid tissue(GALT)

S852.1

A

1001-411X(2014)03-0024-06

2013-09-11 優(yōu)先出版時(shí)間：2014-03-31

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/doi/10.7671/j.issn.1001-411X.2014.03.005.html

李 磊(1985—)，女，碩士研究生，E-mail:lilei1225@hotmail.com;通信作者:欒維民(1957—)，男，教授，博士，E-mail:luanweimin@yahoo.com.cn

國家自然科學(xué)基金(30901065);吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(201205059);“十二五”吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2011431)

李 磊，張英楠，楊樹寶，等.雞嗉囊中淋巴細(xì)胞發(fā)育的研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35(3)：24-29.