韓 翡，焦培榮，韋良孟，2，何 靜，宋亞芬，康銀峰，崔 進(jìn)，張 爍，廖 明，任 濤

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642;2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東泰安 271018)

鴿TLR7基因的克隆、鑒定及表達(dá)分析

韓 翡1，焦培榮1，韋良孟1，2，何 靜1，宋亞芬1，康銀峰1，崔 進(jìn)1，張 爍1，廖 明1，任 濤1

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642;2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東泰安 271018)

【目的】克隆鴿Toll樣受體(Toll-like receptor 7，TLR7)全基因，預(yù)測其主要功能區(qū)域并分析在鴿的各種組織中的表達(dá)情況.【方法】通過RT-PCR、RACE、相對(duì)熒光定量PCR、生物信息學(xué)軟件分析方法進(jìn)行研究.【結(jié)果和結(jié)論】研究發(fā)現(xiàn)鴿TLR7基因cDNA全長3 516 bp，ORF全長3 175 bp，編碼1 048個(gè)氨基酸.其蛋白結(jié)構(gòu)主要由胞外的富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域(LRRs)、跨膜域(TM)和胞內(nèi)的Toll/白介素-1受體結(jié)構(gòu)域(TIR)3部分構(gòu)成.鴿TLR7基因編碼的氨基酸序列與鴻雁Anser cygnoides、綠頭鴨Anas platyrhynchos、雞Gallus gallus和麻雀Taeniopygia guttata的相似性均高于78%，與哺乳動(dòng)物的相似性約為60%，與魚類的相似性低于55%.鴿TLR7基因在小腸、脾臟、腎臟、肝臟中表達(dá)量較高，而在大腦、肺臟、氣管、心臟、胰腺、肌肉、皮膚中表達(dá)量相對(duì)較低.該研究克隆了鴿TLR7全基因，并預(yù)測其主要功能區(qū)域.

鴿;TLR7基因;序列分析;受體表達(dá)

Toll樣受體家族(Toll like receptors，TLRs)是一類介導(dǎo)天然免疫的模式識(shí)別受體，通過識(shí)別病原相關(guān)模式分子，激活信號(hào)通路，調(diào)控炎癥因子的釋放，從而在天然免疫防御中發(fā)揮重要作用［1］.TLRs屬于Ⅰ型跨膜蛋白，可以分為3部分：胞外區(qū)(Extracellular domain，ECD)、跨膜區(qū)(Transmembrane domain，TM)和胞內(nèi)區(qū)(Toll/IL-1 receptor domain，TIR).胞外區(qū)負(fù)責(zé)識(shí)別病原微生物相關(guān)的分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，其是由19～25個(gè)串聯(lián)的富亮氨酸重復(fù)(Leucine-rich repeat.LRR)形成的結(jié)構(gòu)域［2］.Toll樣受體7(Toll-like receptor 7，TLR7)能夠識(shí)別病原微生物的ss RNA和部分短的ds RNA［3-4］.Toll樣受體7基因(TLR7)廣泛存在于DC、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞中［5-6］.近年來，人類TLRs與病原微生物的相互作用研究取得了重大進(jìn)展.同時(shí)，豬、牛、羊、雞、鴨、鵝等家畜的TLR7基因已被成功克?。?-8］，并對(duì)其中某些分子的功能進(jìn)行了深入研究［9-10］.而鴿TLRs基因的克隆和功能預(yù)測以及其在宿主防御病原微生物中的作用研究較少.因此本研究將利用RACE方法克隆鴿TLR7基因，并預(yù)測其主要功能區(qū)，為其深入研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

RNA抽提試劑盒RN easy plus Mini(50)為Qiagen公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV Reverse Transcriptase、T載體(pMD19-T vector)、dNTP、ExTaq酶、3'RACE試劑盒、5'RACE試劑盒、SYBR? Premix ExTaqTM(Perfect Real Time)均為大連寶生物(TaKaRa)公司產(chǎn)品;核酸染料(EB替代)為Bioteke公司產(chǎn)品;膠回收試劑盒為Tiangen公司產(chǎn)品;pfx高保真聚合酶為Invitrogen公司產(chǎn)品;T4 DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品;DNA Marker為東盛生物公司產(chǎn)品;大腸埃希菌DH5α由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病室保存.

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根據(jù)GenBank中已公布TLR7基因序列，雞(Gallus gallus， NM_001011688.2)、鴨(Anas platyrhynchos，DQ888645.1)、人(Homo sapiens，NM _016562.3)、小鼠(Mus musculus，NM_133211.3)等序列為參考序列，應(yīng)用Oligo 7(Molecular Biology Insights Inc.，Cascade，CO)設(shè)計(jì)簡并引物.中間片段S1擴(kuò)增的簡并引物F1/R1.根據(jù)已知參考序列和已經(jīng)擴(kuò)增的S1序列設(shè)計(jì)F2/R2和F3/R3.引物由英濰捷基(廣州)貿(mào)易有限公司(Life technologies)合成.本試驗(yàn)所用引物如表1所示.

表1 試驗(yàn)所用引物Tab.1 PCR primers used in this study

1.2.2 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 取30 mg新鮮鴿子脾臟，按照QIAGEN公司的RNA easy mini kit使用說明書進(jìn)行總RNA抽提.取總RAN 41 μL，加入RNA酶抑制劑1 μL，5×buffer 16 μL，隨機(jī)引物(Random primer和Oligo d T的混合物)4 μL，dNTP 16 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶2 μL，42℃反應(yīng)60～120 min;70℃條件下作用15 min終止反應(yīng).

1.2.3 中間片段S1的PCR擴(kuò)增與序列測定 按照ExTaq酶說明書的推薦體系，擴(kuò)增TLR7基因中間片段(S1).PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min(1 kb/min)，35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min，4℃結(jié)束反應(yīng).

PCR反應(yīng)產(chǎn)物用DNA凝膠純化試劑盒回收.回收產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體，挑取單克隆，菌液PCR法篩選疑似陽性克隆，送測序.

1.2.4 中間片段S2和S3的PCR擴(kuò)增與序列測定

擴(kuò)增方法同S1的擴(kuò)增.

1.2.5 3'端擴(kuò)增(3'RACE) 根據(jù)獲得的S3片段設(shè)計(jì)3'RACE上游引物：GSP1和GSP2;按TaKaRa公司3'RACE試劑盒說明書進(jìn)行操作.獲得TLR7基因3'末端完整序列.

首先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按照說明書推薦體系和程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄.然后進(jìn)行PCR反應(yīng).一輪PCR：50 μL反應(yīng)體系為10× PCR Buffer 4 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，TaKaRaTaq(5 U/μL)0.25 μL，GSP1 0.5 μL，3'Adaptor primer 0.5 μL，上述反轉(zhuǎn)錄液1 μL，ddH2O 40.75 μL;PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min，4℃結(jié)束反應(yīng).二輪PCR反應(yīng)條件同一輪PCR.產(chǎn)物用DNA凝膠純化試劑盒回收，產(chǎn)物連接于pMD19-T載體上，篩選出疑似陽性菌送英濰捷基(廣州)貿(mào)易有限公司測序.

1.2.6 5'端擴(kuò)增(5'RACE) 根據(jù)獲得的S2片段設(shè)計(jì)5'RACE下游引物：5'RACE-R5和5'RACER4，按5'RACE(TaKaRa)試劑盒說明書進(jìn)行操作(類似于3'RACE).

1.2.7TLR7基因的生物信息學(xué)分析 使用Laser gene Edit seq軟件對(duì)擴(kuò)增出的片段進(jìn)行拼接，得到鴿TLR7基因完整序列.使用Meg Align軟件分別對(duì)鴿TLR7基因氨基酸序列與其他動(dòng)物的TLR7基因氨基酸序列進(jìn)行相似性分析、進(jìn)化樹分析.通過NCBI Conserved Domain Database(CDD)在線數(shù)據(jù)庫對(duì)鴿TLR7基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測.

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測鴿TLR7基因組織分布 采集健康鴿的組織(大腦、氣管、肺臟、心臟、肝臟、腎臟、脾臟、胰腺、小腸、肌肉、皮膚、法氏囊)為試驗(yàn)材料，按照QIAGEN公司的RNA easy mini kit使用說明書抽提總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，以其作為模板，以法氏囊作為參比組織，以鴿β-actin作內(nèi)參基因.使用TaKaRa公司的SYBR?Premix ExTaqTM(Perfect real time)試劑盒，反應(yīng)體系為：2×SYBR Green mix 10 μL，上下游引物各0.2 μL，模板cDNA 1 μL，補(bǔ)去離子水至20 μL，每個(gè)樣做3個(gè)重復(fù).

實(shí)時(shí)定量 PCR在 ABI7500檢測系統(tǒng)上進(jìn)行，PCR反應(yīng)程序：95℃ 預(yù)變性5 min;95℃變性15 s，60℃退火加延伸34 s(收集熒光信號(hào))，共40個(gè)循環(huán).反應(yīng)完成后進(jìn)行熔解曲線分析.程序結(jié)束后系統(tǒng)自動(dòng)生成各個(gè)樣品的Ct值和產(chǎn)物的退火溫度值.

1.2.9 數(shù)據(jù)處理與分析 靶基因與內(nèi)參基因(β-actin)的比率計(jì)算根據(jù)2-△△Ct公式［11］.統(tǒng)計(jì)分析使用Graph Pad Prism 5軟件(Graph Pad Software Inc，San Diego，CA).

2 結(jié)果與分析

2.1 鴿TLR7基因的中間片段PCR克隆結(jié)果

分別用引物F1和R1擴(kuò)增得到931 bp的S1片段;引物F2和R2擴(kuò)增得到929 bp的S2片段;引物F3和R3擴(kuò)增得到601 bp的S3片段.BLAST對(duì)比結(jié)果顯示這3個(gè)片段與雞和鴨的TLR7基因相似性較高，說明得到正確的鴿TLR7基因的部分片段(圖1a～1c).

2.2 鴿TLR7基因的3'RACE和5'RACE PCR克隆結(jié)果

通過3'RACE獲得大小為476 bp的3'末端片段，其含有18個(gè)A組成的 poly(A)尾，得到了鴿TLR7基因的3'末端完整序列.通過5'RACE獲得大小為358 bp的5'末端完整序列(圖1d～1e).

2.3 鴿TLR7基因的序列分析

將各序列拼接后得到3 516 bp的鴿TLR7基因全長cDNA序列.序列分析發(fā)現(xiàn)鴿TLR7基因的最長開放閱讀框?yàn)? 175 bp，編碼1 048個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為122 370.3，等電點(diǎn)(PI)為8.74.結(jié)合SMART(圖2)和TMpred Server分析預(yù)測鴿TLR7蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)包含有典型的LRR、TM和TIR區(qū).

2.4 鴿TLR7基因的分子遺傳進(jìn)化分析

氨基酸同源對(duì)比發(fā)現(xiàn)，鴿TLR7基因編碼的氨基酸序列與雁屬類相似性最高，其中與鴻雁Anser cygnoides和綠頭鴨Anas platyrhynchos的相似性分別為81.7%和80.7%，而與雞和麻雀Taeniopygia guttata的相似性次之，分別是78.5%、78.9%，但與靈長類和其他哺乳動(dòng)物的相似性相對(duì)較低，在60.5% ～65.5%之間，與魚類的相似性則低于55%.從進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，鴿TLR7與麻雀TLR7基因編碼的氨基酸序列處于同一分支上，親緣關(guān)系最近;另外，鴿TLR7基因編碼的氨基酸序列與麻雀、雞、鴻雁、綠頭鴨的均處于同一大分支上，親緣關(guān)系較近，而與靈長類和其他哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，與魚類的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖3).

圖1 鴿TLR7基因部分序列鑒定電泳圖Fig.1 Electrophoresis of partial sequence of pigeon TLR7

圖2 鴿TLR7蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 The protein secondary structures of pigeon TLR7

圖3 鴿TLR7氨基酸序列遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of TLR7 amino acid sequence

2.5 鴿TLR7基因在正常組織中的分布情況

通過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)TLR7基因在健康鴿小腸中的表達(dá)量最高，在脾臟、腎臟、肝臟中表達(dá)量相對(duì)較高，在氣管、心臟、胰腺、皮膚中表達(dá)量相對(duì)較低，在大腦、肺臟、肌肉中表達(dá)量最低(圖4).

圖4 定量分析鴿TLR7基因在健康組織中的分布Fig.4 Quantitative analysis of tissue distribution of TLR7 gene transcripts in pigeons

3 討論

模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)是機(jī)體抵御病原微生物感染，啟動(dòng)機(jī)體天然免疫的重要組成部分，在先天性免疫中發(fā)揮了重要作用［12］.病原微生物感染細(xì)胞后，PRRs通過識(shí)別病原的病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，促使下游干擾素和細(xì)胞因子的分泌，激活一些抗細(xì)菌或抗病毒蛋白的表達(dá)，啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答［13］.

人類 TLRs家族主要由 TLR1、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7和TLR11這6個(gè)主要亞家族成員構(gòu)成.其中TLR7亞家族由TLR7、TLR8和TLR9構(gòu)成.雞的Toll樣受體(ch TLRs)和人類相似，其 chTLR2、chTLR4、chTLR5、chTLR7已經(jīng)被發(fā)現(xiàn).分析比較雞和人類基因組信息，發(fā)現(xiàn)雞的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tags，ESTs)和人TLR1/6/10、TLR2、TLR3、TLR5、TLR7相關(guān)序列高度同源.目前，研究表明在雞中至少存在8種TLRs［14］.

本研究根據(jù)已公布的部分物種的TLR7基因序列為參考序列設(shè)計(jì)簡并引物擴(kuò)增部分片段，獲得鴿TLR7基因的部分保守序列，再結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)及生物信息學(xué)分析等技術(shù)，獲得鴿TLR7基因的全長序列.

利用SMART預(yù)測鴿TLR7基因的功能區(qū)，發(fā)現(xiàn)其含有典型的TLRs家族結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成，從N端到C端依次包括信號(hào)肽、LRR、1個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū).與其他物種的氨基酸序列比較，發(fā)現(xiàn)鴿與鴻雁、綠頭鴨、雞、麻雀的氨基酸序列相似性均較高.從進(jìn)化分析結(jié)果顯示，鴿TLR7基因與麻雀親緣關(guān)系最近;鴿、麻雀、雞、綠頭鴨的TLR7基因位于同一進(jìn)化分支，這表明它們的親緣關(guān)系較近.但其與哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，與魚類親緣關(guān)系最遠(yuǎn).

本研究利用熒光定量PCR方法檢測鴿TLR7基因在健康組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在小腸、脾臟、腎臟、肝臟中表達(dá)量較高，而在大腦、肺臟、肌肉、心臟中表達(dá)量較低.因此，鴿TLR7基因在不同組織中的表達(dá)存在差異.

在哺乳動(dòng)物中，TLR7受體能識(shí)別多種小分子抗病毒化合物以及病毒單鏈RNA，通過MyD88依賴的信號(hào)通路誘導(dǎo)促炎癥因子和I型干擾素的產(chǎn)生，介導(dǎo)機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答，同時(shí)TLR7活化促進(jìn)樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DC)表達(dá)共刺激分子和趨化因子受體，延長DC體外存活時(shí)間，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖能力，因而它在天然免疫和獲得性免疫中起到橋梁的作用.在鳥類中，病毒的單鏈RNA是TLR7受體可識(shí)別的配體之一，因此，鳥類對(duì)病毒的易感性可能與相識(shí)別的配體有關(guān).ch TLR7和相應(yīng)配體結(jié)合后會(huì)刺激細(xì)胞產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子和抗病毒蛋白的表達(dá)，包括ch IL-18、ch IL-6、ch IL-8和NOSⅡ等［15］.但關(guān)于TLR7介導(dǎo)的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚，還有待深入研究.

基于TLR7基因在抗病毒天然免疫中的重要作用，本研究克隆了鴿TLR7基因，用生物信息學(xué)方法進(jìn)行了序列分析，并預(yù)測其主要功能區(qū)域，為深入研究其識(shí)別病原相關(guān)分子模式的機(jī)制奠定基礎(chǔ).

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【責(zé)任編輯 柴 焰】

Molecular cloning，characterization and expression analysis of the pigeon toll-like receptor 7 gene

HAN Fei1，JIAO Peirong1，WEI Liangmeng1，2，HE Jing1，SONG Yafen1，KANG Yinfeng1，CUI Jin1，ZHANG Shuo1，LIAO Ming1，REN Tao1
(1 College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University/National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis Prevention and Control/Key Laboratory of Animal Vaccine Development，Ministry of Agriculture/ Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Guangdong，Guangzhou 510642，China; 2 College of Veterinary Medicine，Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China)

【Objective】To clone and characterize the pigeon Toll like receptor 7(TLR7)gene.【Method】RT-PCR，RACE(rapid amplification of cDNA ends)，Quantitative real-time PCR and bio-informatics software was used in this study.【Result and conclusion】The study showed that the full-length of pigeonTLR7 cDNA sequence was 3 516 bp with the longest open reading frame(ORF)of 3 175 bp encoding a peptide of 1 048 amino acids.The deduced amino acid sequence of pigeonTLR7 contained three main structural domains including an extracellular leucine rich repeats domains(LRRs)，a transmembrane domain(TM) and a Toll/IL-1 receptor domain(TIR);pigeonTLR7 shared amino acid sequence similarity with theAnser cygnoides TLR7 gene，Anas platyrhynchos TLR7 gene，Gallus gallus TLR7 gene(above 78%)，mammalTLR7 gene(about 60%)，and fishTLR7 gene(less than 55%).Quantitative real-time PCR analysis revealed that the pigeonTLR7 mRNA widespread expression in the tested tissues was high in small intestine，spleen，kidney and low in brain，lung，trachea，heart，pancreas，muscle and skin.In this studyTLR7 gene has been isolated from pigeon，cloned and its main functional domains have been predicted.

pigeon;TLR7 gene;sequence analysis;receptor expression

S855

A

1001-411X(2014)03-0018-06

2013-10-13 優(yōu)先出版時(shí)間：2014-03-31

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/doi/10.7671/j.issn.1001-411X.2014.03.004.html

韓 翡(1989—)，女，彝族，碩士研究生，E-mail:vshanfei@foxmail.com;通信作者:焦培榮(1974—)，男，副研究員，博士，E-mail:prjiao@yahoo.com;任 濤(1968—)，男，教授，博士，E-mail:rentao@scau.edu.cn

國家自然科學(xué)基金(31172343，31072139，31372412);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303033)

韓 翡，焦培榮，韋良孟，等.鴿TLR7基因的克隆、鑒定及表達(dá)分析［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35(3)：18-23.