云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500

保肝藥物體內(nèi)活性篩選方法的建立

吳愛萍段小花周志宏代蓉淤澤溥*

云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500

目的建立一種穩(wěn)定便捷的保肝藥物活性篩選方法。方法用CCl4復(fù)制小鼠急性肝損傷模型，考察CCl4染毒劑量、染毒時(shí)間及染毒途徑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，選擇陽(yáng)性對(duì)照藥物，多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)來考察方法的穩(wěn)定性。結(jié)果對(duì)小鼠一次性腹腔注射0.2% CCl4橄欖油溶液0.1ml/10g.bw，染毒20h后，模型組小鼠血清ALT、AST均高于正常組 (P<0.01)，可成功復(fù)制急性CCl4肝損傷模型；聯(lián)苯雙酯組小鼠血清ALT低于模型組(P<0.01)，提示其有保肝降酶作用，故選擇聯(lián)苯雙酯作為陽(yáng)性對(duì)照藥；經(jīng)多次方法學(xué)考察，確定已建立了穩(wěn)定的保肝藥物活性篩選實(shí)驗(yàn)方法。結(jié)論對(duì)小鼠一次性腹腔注射0.2%CCl4橄欖油溶液0.1ml/10g.bw，染毒20h，可以成功復(fù)制結(jié)果穩(wěn)定的小鼠CCl4急性肝損傷模型。

急性CCl4肝損傷模型；保肝作用；活性篩選方法

肝臟被譽(yù)為人體的化工廠，在機(jī)體代謝中有極其重要的作用。肝臟疾病是人類最常見的疾病之一, 嚴(yán)重威脅著人類健康。許多因素，如病毒、生物、藥物、理化、酒精及全身性疾病的影響，都可以導(dǎo)致肝損傷。研究證明，無論何種原因引起的肝臟病變，肝細(xì)胞損傷都是其共同的病理基礎(chǔ)[1-3]。肝損傷長(zhǎng)期存在，往往是導(dǎo)致肝纖維化，甚至肝硬化、肝癌發(fā)生的重要始動(dòng)因素。研究開發(fā)具有保肝活性的藥物是防治各類肝臟疾病的重要措施之一，為尋找和發(fā)現(xiàn)更好的保肝藥物，需建立適用于保肝藥物活性篩選的研究方法。我們通過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了穩(wěn)定的小鼠四氯化碳急性肝損傷動(dòng)物模型，成功地應(yīng)用于保肝藥物和活性成分的追蹤篩選研究。

1 材料

昆明種小鼠，清潔級(jí)，雌雄兼用，體重18～22g。均購(gòu)自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，合格證號(hào)：SCXK(川)2008-24。批號(hào)：Dossy2010-12。四氯化碳(CCl4)：分析純，≥99.5%，武漢聯(lián)堿廠，批號(hào)：20040310；益肝靈片： 國(guó)藥準(zhǔn)字Z19994019，每片含水飛薊賓77mg，四川志遠(yuǎn)廣和制藥有限公司，批號(hào)：100901；聯(lián)苯雙酯滴丸：國(guó)藥準(zhǔn)字H33020232，1.5mg×250丸/瓶，5粒/次，每日3次；浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號(hào)：100409、101004。

2 方法

2.1 染毒物質(zhì)的確定 保肝藥物活性篩選的目的是通過規(guī)范化的實(shí)驗(yàn)研究方法，確定受試物是否具有保肝降酶作用及其保肝活性成分所在部位，為進(jìn)一步研究和開發(fā)保肝新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

為了明確受試物中保肝活性成分的存在部位，需建立一種穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好的篩選方法，復(fù)制適當(dāng)?shù)母螕p傷動(dòng)物模型，選擇簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)指標(biāo)。經(jīng)查閱文獻(xiàn)[1-3]，擬建立小鼠CCl4急性化學(xué)性肝損傷模型，用于保肝藥物活性追蹤篩選。

2.2 CCl4染毒劑量、染毒時(shí)間及染毒途徑的考察 通過查閱文獻(xiàn)[4-7]，小鼠CCl4急性肝損傷模型造模的主要影響因素是染毒劑量、染毒時(shí)

間，因此首先考察這兩個(gè)主要因素。染毒劑量決定于毒物的濃度和給藥體積，為了使各組的給藥體積一致，本實(shí)驗(yàn)采用同體積不同濃度的方法，即染毒劑量由濃度決定。故參考文獻(xiàn)[9-12]將CCl4設(shè)置了0.05%、0.1%、0.2%三個(gè)濃度，給藥體積均按0.1ml/10g。染毒時(shí)間是指藥物進(jìn)入機(jī)體后發(fā)揮毒性作用的時(shí)間，也是影響毒性的主要因素，故參考文獻(xiàn)[9-12]選擇12h、16h和20h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。染毒途徑也是必須考慮的，CCl4染毒常用腹腔注射和皮下注射兩種染毒途徑，但皮下注射常有少量藥液從注射部位漏出，影響染毒劑量的準(zhǔn)確性，故本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射。

[4-7]方法，取昆明種清潔級(jí)小鼠100只，雌雄各半，體重18～22g。按體重與性別隨機(jī)分為10組，即正常對(duì)照組和CCl4三個(gè)染毒劑量不同染毒時(shí)間的9個(gè)組(見表1分組)。每組動(dòng)物均為10只。除正常對(duì)照組外，其余各組分別腹腔注射0.05%、0.1%、0.2%三個(gè)不同濃度的CCl4橄欖油溶液0.1ml/10g.bw。造模后(禁食不禁水)12h、16h和20h分別摘眼球取血，以5000r/min離心15min，分離血清，按測(cè)定試劑盒(賴氏法)操作方法分別測(cè)定血清血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。

2.3 陽(yáng)性藥物的選擇 我們首先考慮選擇的陽(yáng)性藥物，其主要成分最好為從中藥或天然藥物得到的活性成分，以利于跟受試樣品作比較。通過查閱文獻(xiàn)[8]，益肝靈主要成分是水飛薊賓，而水飛薊賓為天然藥物水飛薊提取分離得到的活性成分。故選擇益肝靈作為陽(yáng)性藥物進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。

2.3.1 以益肝靈作為陽(yáng)性藥物 參考文獻(xiàn)[9]，取昆明種清潔級(jí)小鼠36只，雌雄各半，體重18～22g。按體重與性別隨機(jī)分為3組，即正常對(duì)照組、肝損傷模型組、益肝靈組，每組動(dòng)物12只。益肝靈組灌胃給予相應(yīng)藥物，其余兩組給予等體積1% CMC-Na，灌胃給藥體積均為0.1ml/10g.bw，1次/d，連續(xù)用藥6d，第6日給藥后30min，除正常對(duì)照組外，其余各組均腹腔注射0.1%的CCl4橄欖油溶液0.1ml/10g.bw，造模后禁食不禁水16h。同時(shí)第7日再給藥一次，末次給藥后30min，摘眼球取血，同前方法離心及分離血清，測(cè)定血清ALT、AST。

2.3.2 以聯(lián)苯雙酯作為陽(yáng)性藥物 參考文獻(xiàn)[10]方法，取昆明種清潔級(jí)小鼠45只，雄性，體重18～22g。按體重與性別隨機(jī)分為3組，即正常對(duì)照組、肝損傷模型組、聯(lián)苯雙酯組，每組動(dòng)物15只。聯(lián)苯雙酯組灌胃給予相應(yīng)藥物，其余兩組給予等體積1% CMC-Na，灌胃給藥體積均為0.1ml/10g.bw，1次/d，連續(xù)用藥6d，第6日給藥后30min，除正常對(duì)照組外，其余各組均腹腔注射0.2%的CCl4橄欖油溶液0.1ml/10g.bw，造模后禁食不禁水20h。同時(shí)第7日再給藥一次，末次給藥后30min，摘眼球取血，同前方法離心及分離血清，測(cè)定血清ALT。

3 結(jié)果

3.1 CCl4不同染毒劑量及不同染毒時(shí)間對(duì)小鼠血清ALT、AST的影響 0.05%染毒劑量的三個(gè)不同時(shí)間組小鼠血清ALT、AST與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明對(duì)小鼠腹腔注射一次0.05%CCl4尚不能引起小鼠急性肝損傷；0.1%染毒劑量的三個(gè)不同時(shí)間組小鼠血清ALT均高于正常對(duì)照組，差異有非常顯著性意義(P<0.01)，但AST要16h后才升高；0.2%染毒劑量的三個(gè)不同時(shí)間組小鼠血清ALT、AST在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于正常對(duì)照組，差異有非常顯著性意義(P<0.01)。見表1。

表1 CCl4不同染毒劑量及不同染毒時(shí)間對(duì)小鼠血清ALT、AST的影響

注：與正常組相比：△P<0.05，△△P<0.01

3.2 益肝靈對(duì)小鼠CCl4急性肝損傷模型ALT、AST的影響 模型組小鼠血清ALT、AST高于正常對(duì)照組，差異有非常顯著性意義(P<0.01)，表明造模成功；益肝靈組小鼠血清ALT、AST與模型組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示益肝靈在所用劑量未顯示出保肝降酶作用。見表2。

表2 益肝靈對(duì)小鼠CCl4急性肝損傷模型ALT、AST的影響

注：與正常組相比：△△P<0.01

由于上述實(shí)驗(yàn)所選擇藥物未顯示出藥效，通過查閱文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中多選擇聯(lián)苯雙酯作為陽(yáng)性藥物，因此以聯(lián)苯雙酯為陽(yáng)性藥物進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，為正式實(shí)驗(yàn)選擇合適的陽(yáng)性藥物及確定其劑量。

3.3 聯(lián)苯雙酯對(duì)小鼠CCl4急性肝損傷模型ALT的影響 模型組小鼠血清ALT高于正常對(duì)照組，差異有非常顯著性意義(P<0.01)，表明造模成功；聯(lián)苯雙酯組小鼠血清ALT低于模型組，差異有非常顯著性意義(P<0.01)。見表3。

表3 聯(lián)苯雙酯對(duì)小鼠CCl4急性肝損傷模型ALT的影響±s)

與正常對(duì)照組相比：△△P<0.01；與模型組相比：**P<0.01

4 討論

對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射一次CCl4橄欖油，血清ALT、AST隨著CCl4染毒劑量的增加而升高：①對(duì)小鼠進(jìn)行0.05%CCl4不同染毒時(shí)間處理，小鼠血清ALT、AST未見明顯變化，表明小鼠腹腔注射一次0.05%CCl4，劑量偏小，尚不能成功復(fù)制急性肝損傷模型。②對(duì)小鼠進(jìn)行0.1%CCl4不同染毒時(shí)間處理，除染毒12h小鼠血清AST未見明顯變化外，染毒12h小鼠血清ALT及染毒16h、20h小鼠血清ALT、AST均明顯升高；表明0.1%CCl4可以復(fù)制輕度急性肝損傷模型，但染毒時(shí)間延長(zhǎng)至20h，ALT未見明顯升高，反而降低。③對(duì)小鼠進(jìn)行0.2%CCl4染毒12h、16h及20h，小鼠血清ALT、AST均明顯升高，均可成功復(fù)制急性肝損傷模型，且造成的肝損傷程度較為適中、穩(wěn)定。故我們認(rèn)為：染毒劑量和染毒時(shí)間這兩個(gè)因素中，劑量因素更為重要。對(duì)小鼠一次性腹腔注射0.2%CCl4橄欖油溶液0.1ml/10g.bw，染毒20 h復(fù)制的模型，肝損傷程度較為合適，易于反映出藥物的保肝降酶作用，將在后續(xù)的保肝藥物活性追蹤篩選實(shí)驗(yàn)中采用。

對(duì)于陽(yáng)性藥物的選擇，在益肝靈和聯(lián)苯雙酯這兩個(gè)藥物中，聯(lián)苯雙酯顯示出良好的保肝降酶作用，因此選擇聯(lián)苯雙酯作為保肝實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照藥。

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2010年度國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目獐牙菜苦苷在水中的熱轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與青葉膽抗肝炎功能的相關(guān)性研究 項(xiàng)目編號(hào)：81060338。

吳愛萍(1981～)，女，云南人，云南中醫(yī)學(xué)院碩士研究生，研究方向：中藥藥理與應(yīng)用。

淤澤溥，藥理學(xué)教授，E-mail：yuzepu@126.com

R285.5

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1007-8517(2014)08-0031-02

2014.02.10)