曹月喬，張國良,2*，王菲菲

(1．淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2．江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點實驗室，江蘇 淮安 223003)

0 引言

近年來，隨著全球經(jīng)濟增長，原油消耗大幅增加，價格持續(xù)走高，能源供應(yīng)及安全問題已成為世界各國需要面對的主要問題之一?；茉丛谏a(chǎn)和使用的過程中排放出大量的二氧化碳和二氧化硫，造成全球變暖。隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，對石油進口的依賴程度不斷加大，開發(fā)新能源和可替代能源，并提高其在能源結(jié)構(gòu)中的比例已經(jīng)迫在眉睫。近十多年來，作為替代能源之一的生物燃料乙醇(根據(jù)可發(fā)酵糖獲得來源，可將燃料乙醇分為：第一代常規(guī)生物燃料——“糖-淀粉”乙醇；第二代纖維素乙醇)在世界和我國已相繼開展研究并進行產(chǎn)業(yè)化，特別是以甘蔗、玉米等糖類作物為原料的第一代燃料乙醇產(chǎn)業(yè)已形成規(guī)模，在世界燃料乙醇供應(yīng)中起到舉足輕重的作用。2011 年，世界燃料乙醇生產(chǎn)大國——美國和巴西的幾乎全部燃料乙醇皆以玉米淀粉及甘蔗中的可發(fā)酵糖為原料生產(chǎn)而來，兩者乙醇產(chǎn)量之和為5900 萬噸，占世界總產(chǎn)量6700 萬噸的88%。

由于第一代生物燃料乙醇存在與人爭糧、與糧爭地以及成本高等問題，嚴(yán)重制約著產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]，不適合我國國情，也不適宜在全國推廣。而纖維素生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源，地球上每年經(jīng)光合作用固定在綠色植物的總碳就達(dá)2×1011噸，其中絕大部分是構(gòu)成植物支撐組織的木質(zhì)纖維。我國作為一個農(nóng)業(yè)大國，生物質(zhì)資源豐富，僅每年產(chǎn)生的秸稈就多達(dá)7億多噸，大力發(fā)展以農(nóng)作物秸稈、木屑、廢紙等纖維素生物質(zhì)(主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[2])為原料的第二代纖維素乙醇被認(rèn)為是最有發(fā)展前途的非糧生物燃料之一，是木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)工業(yè)轉(zhuǎn)化的一個重要方向，具有廣闊的發(fā)展前景。我國對纖維素乙醇的發(fā)展也很支持，政府將采取措施力保實現(xiàn)《可再生能源中長期發(fā)展規(guī)劃》中的任務(wù)——到2020年實現(xiàn)生物燃料乙醇年利用量達(dá)1000萬噸。發(fā)展纖維素乙醇對于解決當(dāng)前石油資源短缺、增加農(nóng)民收入以及減少環(huán)境污染等方面具有十分重要的意義。

利用木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為燃料乙醇的主要生產(chǎn)工藝包括原料預(yù)處理、纖維素水解、五碳糖與六碳糖發(fā)酵、乙醇分離等。本文對纖維素水解及燃料乙醇發(fā)酵工藝的研究進展進行了總結(jié)，并對其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進行了展望。

1 分步水解發(fā)酵(SHF)

SHF工藝是纖維素酶法水解與糖發(fā)酵分步進行，即先用纖維素酶水解木質(zhì)纖維素，再將酶解產(chǎn)生的糖液作為發(fā)酵碳源，纖維素的酶解和酶解液的發(fā)酵分別在不同的反應(yīng)器中進行。其主要特點是水解與發(fā)酵分別都可在它們的最適條件下進行，酶解主要工作條件為50～60℃，pH3～5；發(fā)酵主要工作條件為30～40℃，pH6～8。

在纖維素酶解過程中，纖維二糖的積累會抑制內(nèi)切和外切葡聚糖酶的活性，葡萄糖的積累對于β-葡萄糖苷酶的催化也有一定的抑制作用。隨著水解過程中葡萄糖濃度的不斷升高，酶解反應(yīng)很快就因為產(chǎn)物抑制作用而使反應(yīng)速度降低，反應(yīng)進行不完全，這樣導(dǎo)致酶解糖化效率不高，從而影響后續(xù)發(fā)酵的乙醇得率[3]。

可以通過補加β-葡萄糖苷酶，減少纖維二糖的積累從而降低對外切葡聚糖酶的抑制作用，或者將反應(yīng)器內(nèi)糖化生成的葡萄糖通過超濾膜分離出去，從而消除產(chǎn)物抑制，提高反應(yīng)速度，但超濾膜的大規(guī)模應(yīng)用帶來成本的顯著增加。

2 同步糖化發(fā)酵(SSF)

SSF 工藝是目前木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化乙醇研究中運用最多的一種方法，是纖維素酶法水解與發(fā)酵同步進行。該工藝無需獨立的纖維素水解反應(yīng)器，減少了反應(yīng)器的數(shù)量，并且在加入纖維素酶的同時接種乙醇發(fā)酵的酵母菌，可使生成的葡萄糖被酵母菌發(fā)酵成乙醇，解除了酶解產(chǎn)生的糖的反饋抑制作用，提高了酶解的效率。

該工藝中由于纖維素酶解條件和發(fā)酵條件不匹配，尤其是反應(yīng)適宜溫度的不匹配(酶解適宜溫度50℃，發(fā)酵適宜溫度30℃)，導(dǎo)致發(fā)酵周期長。為了使SSF 工藝的溫度達(dá)到最佳的酶解溫度，縮短發(fā)酵時間，可采用嗜熱酵母和細(xì)菌作為乙醇發(fā)酵菌株，選擇耐高溫酵母菌有利于SSF 技術(shù)的應(yīng)用。Krishna 等采用釀酒酵母同時進行糖化和發(fā)酵時的最佳溫度為38.5℃，而美國國家可再生能源實驗室(NREL)使用釀酒酵母菌發(fā)酵的最佳條件是38℃，在最佳的酶、酵母和最適反應(yīng)條件下，可將80% 以上的纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇[4]。

在SSF工藝中，為兼顧酶解與發(fā)酵溫度，SSF一般采用的溫度為36～38℃，而且為了提高乙醇產(chǎn)率，常常對同步糖化發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化。劉慶玉等以生物預(yù)處理后的玉米秸稈為原料，采用纖維素酶作為纖維素的糖化酶，采用釀酒酵母和樹干畢赤酵母對葡萄糖和木聚糖等混合糖進行同步糖化發(fā)酵制取燃料乙醇[5]。以分光光度法測定發(fā)酵液中的乙醇含量，對發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種比例、纖維素酶用量4個條件進行單因素試驗分析，再通過正交試驗對發(fā)酵條件進行優(yōu)化。得到最適發(fā)酵參數(shù)分別為發(fā)酵溫度36 ℃，發(fā)酵時間96 h，接種比例1∶1，纖維素酶用量40 IU/g，最后乙醇產(chǎn)率為12.03%。

3 同步糖化共發(fā)酵(SSCF)

SSCF工藝是從SSF工藝的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的[6]，與SSF工藝相比，該工藝是纖維素酶法水解與己糖和戊糖發(fā)酵同時進行，且是在同一個發(fā)酵罐中采用發(fā)酵菌種對己糖和戊糖進行發(fā)酵。使用該工藝不僅可以節(jié)省設(shè)備投資費用、有效緩解葡萄糖對纖維素酶的反饋抑制作用，而且還可以提高木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵液中的乙醇濃度。

Georgieva等將預(yù)處理過的小麥秸稈在pH5.0條件下發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)不同濃度的秸稈經(jīng)SSCF工藝發(fā)酵后葡萄糖的利用率均高于90%，且木糖轉(zhuǎn)化率在72%～80%之間[7]。密歇根州立大學(xué)的Jin等以柳枝稷為原料，在pH5.5、35℃條件下加入4%的纖維素酶，采用兩步法SSCF 技術(shù)得到最終木糖的濃度為11.2g/L，乙醇的濃度為32.1g/L，其中葡聚糖的轉(zhuǎn)化率為80.3%，木聚糖的轉(zhuǎn)化率為84.3%，說明該工藝有利于緩解葡萄糖對纖維素酶的反饋抑制作用[8]。

此外，Koskinen 等將分離到的命名為K17、K15 兩株嗜熱厭氧菌共發(fā)酵木質(zhì)纖維素，能同時利用葡萄糖和木糖產(chǎn)生酒精和H2，菌株K17在酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到4%時仍沒有明顯抑制效應(yīng)，有利于發(fā)酵液中乙醇的積累，提高木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵液中最終的乙醇濃度[9]。

該工藝中使用的菌種可以是混菌也可以是木糖代謝工程菌，木糖代謝工程菌一方面可以以有廣泛底物利用特性的微生物(如大腸桿菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌)為基礎(chǔ)，利用其本來就有的木糖、阿拉伯糖轉(zhuǎn)化能力，通過基因工程技術(shù)改善其產(chǎn)物的選擇性(例如導(dǎo)入轉(zhuǎn)化丙酮酸為乙醇的途徑，使其更多地生成乙醇，或阻斷其副產(chǎn)物合成途徑)及其它同合成產(chǎn)物相關(guān)的特性(如耐酒精及其它毒性抑制物的能力)；另一方面以已有很高產(chǎn)物選擇性和其它產(chǎn)物合成特性的乙醇發(fā)酵菌株(如釀酒酵母和運動發(fā)酵單胞菌)為基礎(chǔ)，通過代謝工程手段賦予乙醇發(fā)酵菌株利用戊糖(木糖或阿拉伯糖)發(fā)酵的能力。如NREL將木糖異構(gòu)酶基因(xylA)、木酮糖激酶(xylB)、轉(zhuǎn)酮醇酶基因(talB)及轉(zhuǎn)酮醛酶基因(tktA)利用基因工程方法，成功導(dǎo)入運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobiles)，實現(xiàn)了混合糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇[10]。

4 非等溫同步糖化發(fā)酵(NSSF)

該法生產(chǎn)乙醇的工藝流程很好地解決了纖維素酶糖化與酵母發(fā)酵2個過程中溫度不匹配的矛盾，可節(jié)約纖維素酶30%～40%，同時乙醇的產(chǎn)量和產(chǎn)率均顯著提高。

馬曉軒等將黑曲霉和康寧木霉混合菌經(jīng)過種子擴增后接入秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基，在28℃、150r/min培養(yǎng)，在第140 h時再將培養(yǎng)液調(diào)至pH4.8，于55℃、150 r/min進行酶解5 h，測還原糖量。隨后接入產(chǎn)朊假絲酵母，接種量10%，在28℃、100 r /min條件下發(fā)酵培養(yǎng)48h，測定乙醇產(chǎn)量。結(jié)果顯示采用NSSF法的產(chǎn)糖量顯著大于SSF的產(chǎn)糖量，且NSSF發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量(0.14 g/g干秸稈)顯著大于SSF發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量[11]。原因是纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，并且在一定程度上可以抑制降解微生物對糖的消耗，NSSF法產(chǎn)生了更多的還原糖，而SSF法并不經(jīng)歷此階段。

Kang等利用耐高溫酵母菌CHY1612進行該工藝時，溫度由糖化時的45℃調(diào)節(jié)至發(fā)酵時的35℃，得到的纖維素乙醇產(chǎn)量為34.3 g/L，明顯高于在45℃條件下進行SSF時的產(chǎn)量22.2 g/L[12]。此時葡萄糖轉(zhuǎn)化率為89.3%，乙醇產(chǎn)率為90.6%。

5 直接微生物轉(zhuǎn)化法(DMC)

直接微生物轉(zhuǎn)化法又稱聯(lián)合生物加工工藝(CBP)，是把生物質(zhì)制乙醇過程傳統(tǒng)工藝各單元進行整合，即將纖維素酶的生產(chǎn)、酶解糖化和乙醇發(fā)酵三個單元耦合在一步同時進行[13]，該工藝要求微生物或微生物群既能產(chǎn)生纖維素酶，又能利用可發(fā)酵糖類生產(chǎn)乙醇。這樣既簡化了工藝，又降低了成本。自然界中的某些微生物如Clostridium、Moniliar、Fusarium、Neurospora等都具有直接把生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇的能力。但到目前為止，研究的菌種耐乙醇濃度差，副產(chǎn)物多，乙醇濃度和得率低。

2009年，Mascoma 公司在紐約州Rome生產(chǎn)纖維素乙醇的裝置上使用了該技術(shù)，利用酵母和細(xì)菌共同完成纖維素酶的生產(chǎn)和乙醇發(fā)酵過程，減少了酶生產(chǎn)單元，大大降低了生產(chǎn)費用。

6 間接生產(chǎn)乙醇技術(shù)

除上述直接通過發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方式，還有通過纖維素生物質(zhì)間接生產(chǎn)乙醇的技術(shù)。美國ZeaChem公司將廢木料利用酸水解得到葡萄糖和木糖，利用乙酸發(fā)酵菌將糖轉(zhuǎn)化為乙酸，然后乙酸酯化生成乙酸乙酯，乙酸乙酯加氫生成乙醇，氫氣由酸水解得到的木質(zhì)素氣化生產(chǎn)[14]。該技術(shù)的優(yōu)點在于可以利用整個木質(zhì)纖維素，提高了原料利用率，每噸干物質(zhì)的乙醇產(chǎn)量可達(dá)160加侖，相比于其它工藝，乙醇產(chǎn)率提高了50%。

Phillips將生物質(zhì)在隔絕氧氣的狀態(tài)下進行高溫處理(600～1000℃)，得到混合裂解氣(主要成分是CO、CO2、H2、CH4和N2)；然后混合氣經(jīng)過化學(xué)轉(zhuǎn)化途徑在金屬催化劑作用下轉(zhuǎn)化得到乙醇和C3以上的混合醇[15]。此外，還可以將混合氣整合后進入發(fā)酵設(shè)備，通過細(xì)菌的作用轉(zhuǎn)化成乙醇[16]。該技術(shù)能將全部供入物料都用于氣化，產(chǎn)生極少的廢棄物，同時用水極少，節(jié)約了成本。

7 展望

目前，發(fā)展纖維素燃料乙醇產(chǎn)業(yè)面臨著生產(chǎn)成本居高不下的挑戰(zhàn)，利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇需要滿足以下三個基本技術(shù)要求：簡潔高效的原料預(yù)處理技術(shù)、高效低成本的纖維素酶、戊糖與己糖共發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。因此，應(yīng)該主要從這三個方面著手以降低燃料乙醇的生產(chǎn)成本。

7.1 預(yù)處理技術(shù)

纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理是生產(chǎn)燃料乙醇的關(guān)鍵因素之一[17]。木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，細(xì)胞壁中的半纖維素和木質(zhì)素通過共價鍵聯(lián)結(jié)成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，纖維素鑲嵌其中，阻止酸或酶進入纖維素和半纖維的區(qū)域，使得纖維素難以被水解。通過纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理技術(shù)，改變天然纖維的結(jié)構(gòu)，使纖維素、半纖維素和木質(zhì)素得以分離，增加纖維素與酶的接觸面積，可提高纖維素的水解效率。

目前常見的預(yù)處理方法主要有物理法(機械粉碎法[18]、高溫處理法[19]、微波法[20])；化學(xué)法(酸水解法[21,22]、堿水解法[23]、有機溶劑法[24])；物理化學(xué)法(蒸汽爆破法[25]、氨纖維爆破法[26]、濕氧預(yù)處理法[27,28])；生物法[29]。

預(yù)處理過程中需要消耗大量的化學(xué)品或熱能，增加了設(shè)備投資或污水處理成本。此外，預(yù)處理可能還會產(chǎn)生對發(fā)酵有抑制或毒性的酚、醛、酸等有機物[30]。因此，應(yīng)重點發(fā)展原料轉(zhuǎn)化率高、低耗能、低污染的纖維素預(yù)處理技術(shù)，增加酶與植物纖維接觸的表面積[31]，并消除對微生物有危害的毒性物質(zhì)，以利于生物降解、提高預(yù)處理效率，減少成本。

7.2 纖維素酶

纖維素酶是降解纖維素成為葡萄糖所需的一組酶的總稱，一般認(rèn)為其主要包括3個組分：內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纖維素酶的來源非常廣泛，昆蟲、微生物、細(xì)菌、放線菌、真菌、動物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。目前應(yīng)用于纖維素酶生產(chǎn)的主要是木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、鐮孢菌屬(Fusarium)等菌種。

纖維素水解生成葡萄糖的過程必須依靠纖維素酶的協(xié)同作用才能完成。酶水解工藝具有條件溫和( pH為4.8，溫度為45～55℃) 、能量消耗小、不生成有毒降解產(chǎn)物、糖轉(zhuǎn)化率高、無腐蝕、無環(huán)境污染和無發(fā)酵抑制物等特點。但纖維素酶的生產(chǎn)成本占糖化總成本的60%，為整個生產(chǎn)成本的20%左右[32]。目前使用的纖維素酶的比活力較低，單位原料用酶量很大，酶解效率低。因此，應(yīng)該積極開發(fā)高效生物酶，降低生產(chǎn)成本，優(yōu)化酶水解工藝，從而降低生產(chǎn)纖維素燃料乙醇的成本。

近年來，世界上兩個最大的產(chǎn)酶公司Genencor International 和Novozymes Biotech加大了對纖維素酶的研究力度，努力增加酶活并降低成本，以生產(chǎn)最高效的纖維素酶，如Cellic CTec2 酶[33]等；我國山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點實驗室對纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選和誘變育種以及用基因手段提高產(chǎn)酶量或改進酶系組成等進行了研究。其中，誘變育種是一個有效的途徑，并且已經(jīng)獲得了纖維素酶活力顯著提高的菌株，如斜臥青霉(P.decumbens)JUA10-1、JUA10-S、JUA10-T等。此外，通過基因組重排技術(shù)獲得產(chǎn)酶能力較出發(fā)菌株提高了2 倍以上的GS2-15、GS2-21、GS2-22等[34-38]。

7.3 發(fā)酵微生物

在纖維素生物質(zhì)酶解糖化過程中，有20%左右的半纖維素降解為戊糖，而自然界中高效的乙醇發(fā)酵菌株缺少利用和轉(zhuǎn)化戊糖的能力或轉(zhuǎn)化效率很低，這無疑降低了木質(zhì)纖維素的乙醇轉(zhuǎn)化率[39-41]。而理想的生物質(zhì)乙醇發(fā)酵菌應(yīng)該能夠發(fā)酵所有生物質(zhì)來源的糖，并與纖維素完全水解所需的纖維素酶有協(xié)同作用。因此，構(gòu)建能夠利用戊糖的工程菌就顯得尤為重要。

目前，利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)構(gòu)建基因重組菌株，是獲得代謝葡萄糖和木糖高效產(chǎn)乙醇重組菌株的一條重要途徑。通過打斷琥珀酸合成途徑中的延胡索酸合成酶基因，產(chǎn)生的名為KO11 的大腸桿菌可發(fā)酵半纖維素水解產(chǎn)物中的幾乎所有的糖生產(chǎn)乙醇，其乙醇生產(chǎn)能力較高，并且對木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中的抑制劑具有相對高的耐受性；此外，美國Purdue 大學(xué)將木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶的基因轉(zhuǎn)入了糖化酵母(S.diastaticus)和葡萄汁酵母(S.uvarum)的融合菌株，該菌能同時發(fā)酵葡萄糖和木糖為酒精，提高了發(fā)酵酒度和底物利用率。

7.4 其他

制定原料供應(yīng)保障制度，建立有效的纖維素生物質(zhì)收集、儲存及運輸體系，解決制約纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展的原料供應(yīng)問題，確保纖維素燃料乙醇健康有序發(fā)展；完善燃料乙醇的補貼政策，建議國家根據(jù)燃料乙醇生產(chǎn)原料分別確定補貼，使對纖維素乙醇的補貼高于第一代燃料乙醇，提高社會對發(fā)展該產(chǎn)業(yè)的積極性；此外，建議國家在纖維素燃料乙醇的研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化示范上提供財政支持，并出臺相應(yīng)扶持政策，整合國內(nèi)研發(fā)力量，推動纖維素燃料乙醇產(chǎn)業(yè)化技術(shù)早日實現(xiàn)。

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