岳聰慧+侯大斌+匡青芬

摘要:采用高效液相色譜儀測定不同栽培區(qū)附子的6種生物堿含量和相應(yīng)栽培區(qū)土壤養(yǎng)分。結(jié)果表明,不同栽培區(qū)附子(Aconitum carmichaeli Debx.)的生物堿含量存在明顯差異,土壤養(yǎng)分對附子生物堿含量有較大影響,其中全氮和速效磷對附子中雙酯型生物堿含量影響作用較大。

關(guān)鍵字:附子(Aconitum carmichaeli Debx.);土壤;生物堿

中圖分類號:Q949.746;Q945.79文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2014)11-2594-04

The Comparison and Analysis of Soil Factor on the Content of Diterpenoid Alkaloid in Differen Region of Aconitum carmichaeli

YUE Cong-hui,HOU Da-bin,KUANG Qing-fen

(College of Life Science and Engineering, Southwest Unversityof Science and technology,Mianyang 621000,Sichuan,China)

Abstract: Alkaloid content of Aconitum carmichaeli in different region was studied through High Performance Liquid Chromatography(HPLC). The soil factor was measured to analyze the effects of conent of alkaloid of A. carmichaeli on the Dexb in differentregion. The results showed that the content ofalkaloidin differenregion ofA. carmichaeli were obviously different. Soil factors like total nitrogenand effcient phosphorus of soil had greatest direct-acting onthe content of the diterpenoid alkaloids. The effects of soil factor on the content of alkaloid in different region of A. carmichaeli can be used to provide the basis for planting.

Key words: Aconitum carmichaeli Dexb.; soil factor; alkaloid

基金項(xiàng)目:國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI13B05);四川省“十二五”農(nóng)作物育種攻關(guān)項(xiàng)目(2011NZ0098-12)

附子為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaeli Debx.)的子根,有回陽救逆、除濕散寒的作用[1],是常用的重要中藥材。20世紀(jì)70年代以后,附子栽培得到推廣,現(xiàn)主要分布于四川、陜西、云南等省,其中四川江油是附子的道地產(chǎn)地。不同栽培區(qū)的同種藥材,常會因?yàn)榉N質(zhì)、氣候環(huán)境以及土壤理化性質(zhì)等多種因素的影響而使藥效產(chǎn)生差異。附子的主要藥用活性成分是生物堿,附子類藥材中單酯型和雙酯型生物堿是附子的主要定量分析指標(biāo)。本試驗(yàn)以不同栽培區(qū)附子雙酯型生物堿以及總生物堿的含量為指標(biāo),對相應(yīng)地區(qū)土壤的養(yǎng)分進(jìn)行分析,考察土壤養(yǎng)分對于附子生物堿含量的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試土壤在四川布拖火烈、陜西城固二里、陜西勉縣元墩、云南祿勸茂山、四川北川桂溪、四川江油6個(gè)主要栽培區(qū)的不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的附子種植基地采集土壤樣品,每個(gè)栽培區(qū)采集3份。以“S”形采樣法選取5個(gè)采樣點(diǎn),在每個(gè)采樣點(diǎn)鏟取0~20 cm的土壤樣品,自然風(fēng)干。研磨,過篩,密封備用。

1.1.2供試藥材在四川布拖火烈、陜西城固二里、陜西勉縣元墩、云南祿勸茂山、四川北川桂溪、四川江油6個(gè)附子種植基地,采集健康、無病蟲害的附子植株,每個(gè)種植基地選取附子樣品30株,采集各品種大小均勻的新鮮附子,用自來水清洗干凈,再用去離子水漂洗兩次,切成3 cm厚的片狀,裝入牛皮紙袋,放入烘箱105 ℃烘30 min,然后在65 ℃下烘干至恒重,粉碎備用,各樣品具體情況見表1。

1.1.3試驗(yàn)儀器AGILENT 1260液相色譜儀(美國安捷倫公司);ETHOS ONE微波消解儀(意大利MILESTONE公司);AA700原子吸收光譜儀(美國PE公司);電子分析天平(SARTORIUS公司);優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI公司);T6普析通用新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)(北京普析);超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);752型紫外可見分光光度計(jì)(上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司);中草藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司);高速冷凍離心機(jī)(EPPENDORF公司);HHS216電熱恒溫水浴鍋(常熟醫(yī)療器械);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海蘇達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax Extend-C18(250 mm×416 mm,5 μm)色譜柱,柱溫25 ℃,檢測波長240 nm,流動(dòng)相為A和B 兩相梯度洗脫[A:乙腈;B:40 mmol/L乙酸銨緩沖液(氨水調(diào)pH 10.0);洗脫程序:0~10 min,A 為28%;10~15 min,A 為28%~33%;15~45 min,A 為33%~50%;45~60 min,A 為50%],流速為1.0 mL/min。進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備準(zhǔn)確吸取0.51 mg/mL次烏頭堿、0.38 mg/mL烏頭堿、0.45 mg/mL中烏頭堿各1 mL的混合標(biāo)品溶液分別進(jìn)樣2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μL,平行進(jìn)樣3次,記錄峰面積。以平均峰面積(y,mAu)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(x,μg/mL)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸。各物質(zhì)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表2。

1.2.3總生物堿生物堿含量的測定采用酸性染料比色法[10]。

1.2.4土壤理化性質(zhì)的測定土壤肥力指標(biāo)的測定參考《土壤分析技術(shù)規(guī)范》,其中土壤有機(jī)質(zhì)采用油浴加熱重鉻酸鉀氧化—容量法;土壤全氮采用凱氏定氮法;速效磷采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法;土壤速效鉀采用原子吸收分光光度法。

2結(jié)果與分析

2.1精密度試驗(yàn)

將“1.2.2”中的含適宜濃度的生物堿對照品溶液,按“1.2.1”中色譜條件連續(xù)平行進(jìn)樣5次,記錄各次的峰面積,并計(jì)算其RSD值。結(jié)果顯示,中烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿的RSD值分別為0.61%、 0.21%、0.74%、。

2.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一附子生藥材供試品溶液,室溫放置0、2、4、6、8、10、12、24、36 h后,按“1.2.1”中色譜條件平行進(jìn)樣3次,記錄各次峰面積,計(jì)算各自的生物堿含量。結(jié)果顯示,中烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿在不同時(shí)間量的RSD值分別為0.76%、0.84%、0.93%。

2.3重復(fù)性試驗(yàn)

稱取附子生藥材細(xì)粉共5份,每份約2 g,按樣品制備方法制備供試品溶液,按“1.2.1”中色譜條件測平行樣3次,記錄各次峰面積,計(jì)算3種單酯型生物堿的含量,結(jié)果顯示中烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為0.48%、0.36%、0.45%。

2.4加樣回收率試驗(yàn)

稱取附子干燥細(xì)粉末共15份,每份1 g,每5份用于一種生物堿的回收率的測定,一共3組。每一組樣品分別加入相同對照品溶液適量,按樣品制備方法進(jìn)行供試品溶液的制備和色譜分析。根據(jù)測得量和加入量計(jì)算其回收率。計(jì)算結(jié)果表明,中烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿平均加樣回收率(n=5)分別為99.1%、99.4%、99.0%;RSD值分別為1.21%、1.41%、1.17%。

2.5不同產(chǎn)地附子中6種生物堿含量的比較

不同產(chǎn)地的附子雙酯型生物堿及總堿含量的分析結(jié)果見表3。由表3可知,不同栽培區(qū)附子的雙酯型生物堿以及總堿含量差異明顯。其中就總堿含量比較,006號四川江油種源總堿含量明顯高于其他5個(gè)栽培區(qū)總堿含量,這與附子道地產(chǎn)區(qū)質(zhì)量較高的結(jié)論相符合;就雙酯型生物堿含量比較而言,3種雙酯型生物堿含量總和從631.66 μg/g到1 156.80 μg/g,平均931.13 μg/g,四川布拖、四川北川以及四川江油(001、005、006)種源明顯高于陜西勉縣、陜西城固以及云南布拖(002、003、004)3種種源。這可能與各栽培區(qū)的自然環(huán)境、土壤條件以及栽種水平等多種因素有關(guān)。

2.6不同栽培區(qū)土壤養(yǎng)分含量的比較

不同栽培區(qū)土壤養(yǎng)分的含量見表4。由表4可知,附子不同栽培區(qū)土壤理化性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),不同栽培區(qū)土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效磷、速效鉀均存在明顯差異。其中四川布拖以及四川江油(001和006)的全氮以及有機(jī)質(zhì)含量明顯高于其他4個(gè)栽培區(qū);陜西城固、勉縣以及云南祿勸3個(gè)栽培區(qū)土壤養(yǎng)分含量較低,而四川北川、江油、布拖栽培區(qū)土壤肥力狀況較好,速效磷和速效鉀的含量明顯高于陜西城固、勉縣以及云南祿勸3個(gè)栽培區(qū)。這一結(jié)果與四川地區(qū)的附子產(chǎn)品質(zhì)量高于陜西以及云南地區(qū)產(chǎn)品的現(xiàn)象相一致。但是附子生長以及成分積累不僅與土壤條件有關(guān),遺傳、環(huán)境以及栽種方式等因素都與其有密切關(guān)聯(lián)。

2.7土壤養(yǎng)分與附子中雙酯型生物堿和總堿的相關(guān)性

土壤養(yǎng)分與附子中雙酯型生物堿和總堿相關(guān)性系數(shù)見表5。

由表5可知,將不同栽培區(qū)附子中雙酯型生物堿及總量與相應(yīng)土壤理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析,中烏頭堿與速效鉀有顯著相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)為0.888;烏頭堿與速效磷有極顯著相關(guān)性,與速效鉀有顯著相關(guān)性;次烏頭堿與速效鉀有顯著相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)為0.813;雙酯型生物堿總量與速效磷、速效鉀有顯著相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.840、0.897。附子生物堿總堿與土壤中的速效磷有顯著相關(guān)性,且與中烏頭堿、次烏頭堿及雙酯型生物堿總量有顯著相關(guān)性;雙酯型生物堿總量與全氮以及pH無顯著相關(guān)性。次烏頭堿與中烏頭堿和烏頭堿均有顯著相關(guān)性。

3小結(jié)與討論

中藥材中的有效成分主要為植物次生代謝產(chǎn)物,生物堿是附子的生理活性物質(zhì),同時(shí)也是毒性物質(zhì)。通過比較分析可以看出,不同栽培區(qū)的附子品種間雙酯型生物堿以及總堿含量差異明顯。四川江油、北川以及布拖3個(gè)栽培區(qū)附子的生物堿含量明顯高于陜西勉縣、城固以及云南祿勸3個(gè)栽培區(qū)。這與6個(gè)栽培區(qū)土壤養(yǎng)分含量的比較分析的結(jié)論基本一致。因此土壤因子對附子中生物堿的含量有明顯影響,但除了土壤條件外,附子中雙酯型生物堿含量的高低可能還與有機(jī)體的遺傳特性、植物生長的外界環(huán)境以及栽培方式等因素密切相關(guān)。眾所周知四川人工栽培附子的歷史悠久,四川江油地區(qū)附子的種植方式明顯較其他栽培區(qū)精細(xì),因此建立附子最優(yōu)化栽培方式,實(shí)現(xiàn)附子高產(chǎn)、高品質(zhì)、高效益的栽培模式是附子研究領(lǐng)域內(nèi)存在并亟待解決的問題。

生物堿為附子的主要活性成分,是影響附子藥理作用的主要因素。土壤作為重要的生態(tài)因子對附子的質(zhì)量有較大影響,其理化性質(zhì)明顯影響附子中化學(xué)成分的含量。土壤的理化性質(zhì)是土壤肥力的重要指標(biāo),研究其對附子生物堿含量的影響,對于建立附子最優(yōu)化栽培方式具有重要的意義。

附子生長和有效成分積累除了受土壤條件影響外,氣象條件也可以直接影響植物的光合作用等生理活動(dòng),或通過改變土壤的理化性質(zhì)來間接影響植物的生長發(fā)育和次生代謝物質(zhì)的積累。由于土壤的固有性質(zhì)較難改變,但可以通過追施不同比例的有機(jī)肥來提高藥材的質(zhì)量以及產(chǎn)量。一般在生產(chǎn)上,常用氮、磷、鉀以及有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分含量的多少來衡量土壤肥力的高低。四川江油、四川北川、四川布拖、云南祿勸、陜西勉縣、陜西城固6個(gè)栽培區(qū)土壤中有機(jī)質(zhì)、全氮、速效磷、速效鉀含量存明顯差異。

相關(guān)性分析表明不同栽培區(qū)附子中生物堿的含量與相應(yīng)土壤的理化性質(zhì)有一定的相關(guān)性。 中烏頭堿與速效鉀有顯著相關(guān)性;烏頭堿與速效磷有極顯著相關(guān)性,與速效鉀有顯著相關(guān)性;雙酯型生物堿總量與速效磷有顯著相關(guān)性。

附子是植物烏頭的側(cè)根,而磷是植物根系生長的必要成分,土壤中磷的豐缺狀況以及供應(yīng)強(qiáng)度直接影響著附子的生長發(fā)育、產(chǎn)量以及品質(zhì)。土壤中速效磷含量低會影響附子根系生長,也會影響附子生物堿的積累。土壤中鉀的含量對于附子植株生長具有重要影響,附子中烏頭堿和次烏頭堿以及雙酯型生物堿總量均與速效鉀含量有極顯著相關(guān)性。在材料005和006中雙酯型生物堿的含量均較高,其相應(yīng)土壤中速效磷和速效鉀含量亦高,這與相關(guān)性分析結(jié)果相一致。因此適當(dāng)追施磷肥和鉀肥可有效提高附子中雙酯型生物堿的含量。

附子生物堿含量與土壤有機(jī)質(zhì)和pH無顯著相關(guān)性,這就暗示,土壤中適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)質(zhì)以及pH可能有利于附子的生長,也有可能有利于附子產(chǎn)量的提高,但對附子中生物堿的含量沒有明顯影響。

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[10] 李云霞,孫照,郭艷玲.酸性染料比色法測定川烏、草烏中總烏頭生物堿的含量[J].中成藥,2000,22(9):662-663.

取同一附子生藥材供試品溶液,室溫放置0、2、4、6、8、10、12、24、36 h后,按“1.2.1”中色譜條件平行進(jìn)樣3次,記錄各次峰面積,計(jì)算各自的生物堿含量。結(jié)果顯示,中烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿在不同時(shí)間量的RSD值分別為0.76%、0.84%、0.93%。

2.3重復(fù)性試驗(yàn)

稱取附子生藥材細(xì)粉共5份,每份約2 g,按樣品制備方法制備供試品溶液,按“1.2.1”中色譜條件測平行樣3次,記錄各次峰面積,計(jì)算3種單酯型生物堿的含量,結(jié)果顯示中烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為0.48%、0.36%、0.45%。

2.4加樣回收率試驗(yàn)

稱取附子干燥細(xì)粉末共15份,每份1 g,每5份用于一種生物堿的回收率的測定,一共3組。每一組樣品分別加入相同對照品溶液適量,按樣品制備方法進(jìn)行供試品溶液的制備和色譜分析。根據(jù)測得量和加入量計(jì)算其回收率。計(jì)算結(jié)果表明,中烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿平均加樣回收率(n=5)分別為99.1%、99.4%、99.0%;RSD值分別為1.21%、1.41%、1.17%。

2.5不同產(chǎn)地附子中6種生物堿含量的比較

不同產(chǎn)地的附子雙酯型生物堿及總堿含量的分析結(jié)果見表3。由表3可知,不同栽培區(qū)附子的雙酯型生物堿以及總堿含量差異明顯。其中就總堿含量比較,006號四川江油種源總堿含量明顯高于其他5個(gè)栽培區(qū)總堿含量,這與附子道地產(chǎn)區(qū)質(zhì)量較高的結(jié)論相符合;就雙酯型生物堿含量比較而言,3種雙酯型生物堿含量總和從631.66 μg/g到1 156.80 μg/g,平均931.13 μg/g,四川布拖、四川北川以及四川江油(001、005、006)種源明顯高于陜西勉縣、陜西城固以及云南布拖(002、003、004)3種種源。這可能與各栽培區(qū)的自然環(huán)境、土壤條件以及栽種水平等多種因素有關(guān)。

2.6不同栽培區(qū)土壤養(yǎng)分含量的比較

不同栽培區(qū)土壤養(yǎng)分的含量見表4。由表4可知,附子不同栽培區(qū)土壤理化性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),不同栽培區(qū)土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效磷、速效鉀均存在明顯差異。其中四川布拖以及四川江油(001和006)的全氮以及有機(jī)質(zhì)含量明顯高于其他4個(gè)栽培區(qū);陜西城固、勉縣以及云南祿勸3個(gè)栽培區(qū)土壤養(yǎng)分含量較低,而四川北川、江油、布拖栽培區(qū)土壤肥力狀況較好,速效磷和速效鉀的含量明顯高于陜西城固、勉縣以及云南祿勸3個(gè)栽培區(qū)。這一結(jié)果與四川地區(qū)的附子產(chǎn)品質(zhì)量高于陜西以及云南地區(qū)產(chǎn)品的現(xiàn)象相一致。但是附子生長以及成分積累不僅與土壤條件有關(guān),遺傳、環(huán)境以及栽種方式等因素都與其有密切關(guān)聯(lián)。

2.7土壤養(yǎng)分與附子中雙酯型生物堿和總堿的相關(guān)性

土壤養(yǎng)分與附子中雙酯型生物堿和總堿相關(guān)性系數(shù)見表5。

由表5可知,將不同栽培區(qū)附子中雙酯型生物堿及總量與相應(yīng)土壤理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析,中烏頭堿與速效鉀有顯著相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)為0.888;烏頭堿與速效磷有極顯著相關(guān)性,與速效鉀有顯著相關(guān)性;次烏頭堿與速效鉀有顯著相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)為0.813;雙酯型生物堿總量與速效磷、速效鉀有顯著相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.840、0.897。附子生物堿總堿與土壤中的速效磷有顯著相關(guān)性,且與中烏頭堿、次烏頭堿及雙酯型生物堿總量有顯著相關(guān)性;雙酯型生物堿總量與全氮以及pH無顯著相關(guān)性。次烏頭堿與中烏頭堿和烏頭堿均有顯著相關(guān)性。

3小結(jié)與討論

中藥材中的有效成分主要為植物次生代謝產(chǎn)物,生物堿是附子的生理活性物質(zhì),同時(shí)也是毒性物質(zhì)。通過比較分析可以看出,不同栽培區(qū)的附子品種間雙酯型生物堿以及總堿含量差異明顯。四川江油、北川以及布拖3個(gè)栽培區(qū)附子的生物堿含量明顯高于陜西勉縣、城固以及云南祿勸3個(gè)栽培區(qū)。這與6個(gè)栽培區(qū)土壤養(yǎng)分含量的比較分析的結(jié)論基本一致。因此土壤因子對附子中生物堿的含量有明顯影響,但除了土壤條件外,附子中雙酯型生物堿含量的高低可能還與有機(jī)體的遺傳特性、植物生長的外界環(huán)境以及栽培方式等因素密切相關(guān)。眾所周知四川人工栽培附子的歷史悠久,四川江油地區(qū)附子的種植方式明顯較其他栽培區(qū)精細(xì),因此建立附子最優(yōu)化栽培方式,實(shí)現(xiàn)附子高產(chǎn)、高品質(zhì)、高效益的栽培模式是附子研究領(lǐng)域內(nèi)存在并亟待解決的問題。

生物堿為附子的主要活性成分,是影響附子藥理作用的主要因素。土壤作為重要的生態(tài)因子對附子的質(zhì)量有較大影響,其理化性質(zhì)明顯影響附子中化學(xué)成分的含量。土壤的理化性質(zhì)是土壤肥力的重要指標(biāo),研究其對附子生物堿含量的影響,對于建立附子最優(yōu)化栽培方式具有重要的意義。

附子生長和有效成分積累除了受土壤條件影響外,氣象條件也可以直接影響植物的光合作用等生理活動(dòng),或通過改變土壤的理化性質(zhì)來間接影響植物的生長發(fā)育和次生代謝物質(zhì)的積累。由于土壤的固有性質(zhì)較難改變,但可以通過追施不同比例的有機(jī)肥來提高藥材的質(zhì)量以及產(chǎn)量。一般在生產(chǎn)上,常用氮、磷、鉀以及有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分含量的多少來衡量土壤肥力的高低。四川江油、四川北川、四川布拖、云南祿勸、陜西勉縣、陜西城固6個(gè)栽培區(qū)土壤中有機(jī)質(zhì)、全氮、速效磷、速效鉀含量存明顯差異。

相關(guān)性分析表明不同栽培區(qū)附子中生物堿的含量與相應(yīng)土壤的理化性質(zhì)有一定的相關(guān)性。 中烏頭堿與速效鉀有顯著相關(guān)性;烏頭堿與速效磷有極顯著相關(guān)性,與速效鉀有顯著相關(guān)性;雙酯型生物堿總量與速效磷有顯著相關(guān)性。

附子是植物烏頭的側(cè)根,而磷是植物根系生長的必要成分,土壤中磷的豐缺狀況以及供應(yīng)強(qiáng)度直接影響著附子的生長發(fā)育、產(chǎn)量以及品質(zhì)。土壤中速效磷含量低會影響附子根系生長,也會影響附子生物堿的積累。土壤中鉀的含量對于附子植株生長具有重要影響,附子中烏頭堿和次烏頭堿以及雙酯型生物堿總量均與速效鉀含量有極顯著相關(guān)性。在材料005和006中雙酯型生物堿的含量均較高,其相應(yīng)土壤中速效磷和速效鉀含量亦高,這與相關(guān)性分析結(jié)果相一致。因此適當(dāng)追施磷肥和鉀肥可有效提高附子中雙酯型生物堿的含量。

附子生物堿含量與土壤有機(jī)質(zhì)和pH無顯著相關(guān)性,這就暗示,土壤中適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)質(zhì)以及pH可能有利于附子的生長,也有可能有利于附子產(chǎn)量的提高,但對附子中生物堿的含量沒有明顯影響。

參考文獻(xiàn):

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取同一附子生藥材供試品溶液,室溫放置0、2、4、6、8、10、12、24、36 h后,按“1.2.1”中色譜條件平行進(jìn)樣3次,記錄各次峰面積,計(jì)算各自的生物堿含量。結(jié)果顯示,中烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿在不同時(shí)間量的RSD值分別為0.76%、0.84%、0.93%。

2.3重復(fù)性試驗(yàn)

稱取附子生藥材細(xì)粉共5份,每份約2 g,按樣品制備方法制備供試品溶液,按“1.2.1”中色譜條件測平行樣3次,記錄各次峰面積,計(jì)算3種單酯型生物堿的含量,結(jié)果顯示中烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為0.48%、0.36%、0.45%。

2.4加樣回收率試驗(yàn)

稱取附子干燥細(xì)粉末共15份,每份1 g,每5份用于一種生物堿的回收率的測定,一共3組。每一組樣品分別加入相同對照品溶液適量,按樣品制備方法進(jìn)行供試品溶液的制備和色譜分析。根據(jù)測得量和加入量計(jì)算其回收率。計(jì)算結(jié)果表明,中烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿平均加樣回收率(n=5)分別為99.1%、99.4%、99.0%;RSD值分別為1.21%、1.41%、1.17%。

2.5不同產(chǎn)地附子中6種生物堿含量的比較

不同產(chǎn)地的附子雙酯型生物堿及總堿含量的分析結(jié)果見表3。由表3可知,不同栽培區(qū)附子的雙酯型生物堿以及總堿含量差異明顯。其中就總堿含量比較,006號四川江油種源總堿含量明顯高于其他5個(gè)栽培區(qū)總堿含量,這與附子道地產(chǎn)區(qū)質(zhì)量較高的結(jié)論相符合;就雙酯型生物堿含量比較而言,3種雙酯型生物堿含量總和從631.66 μg/g到1 156.80 μg/g,平均931.13 μg/g,四川布拖、四川北川以及四川江油(001、005、006)種源明顯高于陜西勉縣、陜西城固以及云南布拖(002、003、004)3種種源。這可能與各栽培區(qū)的自然環(huán)境、土壤條件以及栽種水平等多種因素有關(guān)。

2.6不同栽培區(qū)土壤養(yǎng)分含量的比較

不同栽培區(qū)土壤養(yǎng)分的含量見表4。由表4可知,附子不同栽培區(qū)土壤理化性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),不同栽培區(qū)土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效磷、速效鉀均存在明顯差異。其中四川布拖以及四川江油(001和006)的全氮以及有機(jī)質(zhì)含量明顯高于其他4個(gè)栽培區(qū);陜西城固、勉縣以及云南祿勸3個(gè)栽培區(qū)土壤養(yǎng)分含量較低,而四川北川、江油、布拖栽培區(qū)土壤肥力狀況較好,速效磷和速效鉀的含量明顯高于陜西城固、勉縣以及云南祿勸3個(gè)栽培區(qū)。這一結(jié)果與四川地區(qū)的附子產(chǎn)品質(zhì)量高于陜西以及云南地區(qū)產(chǎn)品的現(xiàn)象相一致。但是附子生長以及成分積累不僅與土壤條件有關(guān),遺傳、環(huán)境以及栽種方式等因素都與其有密切關(guān)聯(lián)。

2.7土壤養(yǎng)分與附子中雙酯型生物堿和總堿的相關(guān)性

土壤養(yǎng)分與附子中雙酯型生物堿和總堿相關(guān)性系數(shù)見表5。

由表5可知,將不同栽培區(qū)附子中雙酯型生物堿及總量與相應(yīng)土壤理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析,中烏頭堿與速效鉀有顯著相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)為0.888;烏頭堿與速效磷有極顯著相關(guān)性,與速效鉀有顯著相關(guān)性;次烏頭堿與速效鉀有顯著相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)為0.813;雙酯型生物堿總量與速效磷、速效鉀有顯著相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.840、0.897。附子生物堿總堿與土壤中的速效磷有顯著相關(guān)性,且與中烏頭堿、次烏頭堿及雙酯型生物堿總量有顯著相關(guān)性;雙酯型生物堿總量與全氮以及pH無顯著相關(guān)性。次烏頭堿與中烏頭堿和烏頭堿均有顯著相關(guān)性。

3小結(jié)與討論

中藥材中的有效成分主要為植物次生代謝產(chǎn)物,生物堿是附子的生理活性物質(zhì),同時(shí)也是毒性物質(zhì)。通過比較分析可以看出,不同栽培區(qū)的附子品種間雙酯型生物堿以及總堿含量差異明顯。四川江油、北川以及布拖3個(gè)栽培區(qū)附子的生物堿含量明顯高于陜西勉縣、城固以及云南祿勸3個(gè)栽培區(qū)。這與6個(gè)栽培區(qū)土壤養(yǎng)分含量的比較分析的結(jié)論基本一致。因此土壤因子對附子中生物堿的含量有明顯影響,但除了土壤條件外,附子中雙酯型生物堿含量的高低可能還與有機(jī)體的遺傳特性、植物生長的外界環(huán)境以及栽培方式等因素密切相關(guān)。眾所周知四川人工栽培附子的歷史悠久,四川江油地區(qū)附子的種植方式明顯較其他栽培區(qū)精細(xì),因此建立附子最優(yōu)化栽培方式,實(shí)現(xiàn)附子高產(chǎn)、高品質(zhì)、高效益的栽培模式是附子研究領(lǐng)域內(nèi)存在并亟待解決的問題。

生物堿為附子的主要活性成分,是影響附子藥理作用的主要因素。土壤作為重要的生態(tài)因子對附子的質(zhì)量有較大影響,其理化性質(zhì)明顯影響附子中化學(xué)成分的含量。土壤的理化性質(zhì)是土壤肥力的重要指標(biāo),研究其對附子生物堿含量的影響,對于建立附子最優(yōu)化栽培方式具有重要的意義。

附子生長和有效成分積累除了受土壤條件影響外,氣象條件也可以直接影響植物的光合作用等生理活動(dòng),或通過改變土壤的理化性質(zhì)來間接影響植物的生長發(fā)育和次生代謝物質(zhì)的積累。由于土壤的固有性質(zhì)較難改變,但可以通過追施不同比例的有機(jī)肥來提高藥材的質(zhì)量以及產(chǎn)量。一般在生產(chǎn)上,常用氮、磷、鉀以及有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分含量的多少來衡量土壤肥力的高低。四川江油、四川北川、四川布拖、云南祿勸、陜西勉縣、陜西城固6個(gè)栽培區(qū)土壤中有機(jī)質(zhì)、全氮、速效磷、速效鉀含量存明顯差異。

相關(guān)性分析表明不同栽培區(qū)附子中生物堿的含量與相應(yīng)土壤的理化性質(zhì)有一定的相關(guān)性。 中烏頭堿與速效鉀有顯著相關(guān)性;烏頭堿與速效磷有極顯著相關(guān)性,與速效鉀有顯著相關(guān)性;雙酯型生物堿總量與速效磷有顯著相關(guān)性。

附子是植物烏頭的側(cè)根,而磷是植物根系生長的必要成分,土壤中磷的豐缺狀況以及供應(yīng)強(qiáng)度直接影響著附子的生長發(fā)育、產(chǎn)量以及品質(zhì)。土壤中速效磷含量低會影響附子根系生長,也會影響附子生物堿的積累。土壤中鉀的含量對于附子植株生長具有重要影響,附子中烏頭堿和次烏頭堿以及雙酯型生物堿總量均與速效鉀含量有極顯著相關(guān)性。在材料005和006中雙酯型生物堿的含量均較高,其相應(yīng)土壤中速效磷和速效鉀含量亦高,這與相關(guān)性分析結(jié)果相一致。因此適當(dāng)追施磷肥和鉀肥可有效提高附子中雙酯型生物堿的含量。

附子生物堿含量與土壤有機(jī)質(zhì)和pH無顯著相關(guān)性,這就暗示,土壤中適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)質(zhì)以及pH可能有利于附子的生長,也有可能有利于附子產(chǎn)量的提高,但對附子中生物堿的含量沒有明顯影響。

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