鄭敏 葉清 楊成廣 徐燁 郭明 徐志飛

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院胸外科，上海 200061; 2.上海市長寧區(qū)中心醫(yī)院胸外科，上海 200336；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院胸外科，上海 201210)

MUC1黏蛋白(簡稱MUC1)是由MUC1基因編碼的一種高糖基化的高分子量蛋白。MUC1對正常上皮有潤滑和保護(hù)作用，還可介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞黏附等。研究[1]表明，MUC1在食管癌、胃腸癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中均有不同程度的異常表達(dá)，且與患者的預(yù)后有相關(guān)性。本研究以裸鼠為實(shí)驗對象，以研究MUC1與食管癌對紫杉醇和順鉑藥物敏感性的關(guān)系，為臨床個體化用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 MUC1過表達(dá)的食管癌細(xì)胞株(c-7細(xì)胞)及MUC1穩(wěn)定沉默的食管癌細(xì)胞株(4-9細(xì)胞)由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞分化與凋亡實(shí)驗室提供；4周齡BALB/c雌性裸鼠購自上海斯萊克實(shí)驗動物有限公司；順鉑注射液購自江蘇豪森制藥有限公司，紫杉醇注射液購自中美上海施貴寶藥業(yè)有限公司；羊抗鼠Ki-67一抗及羊抗鼠Bcl-2一抗購自美國Santa Cruz公司，兔抗羊二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的c-7細(xì)胞和4-9細(xì)胞進(jìn)行快速復(fù)蘇，放入37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)多次傳代之后，收集足量細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/mL，使活細(xì)胞比率>90％。

1.3 裸鼠移植瘤實(shí)驗 購買的裸鼠于SPF級動物房喂養(yǎng)1周以上，將收集的細(xì)胞懸液輕輕吹打均勻，取0.2 mL細(xì)胞懸液(約2×106/個細(xì)胞)，接種于裸鼠的左腋皮下，形成單一皮丘，避免滲漏。接種1周后，腫瘤生長至黃豆大小。

1.4 藥物實(shí)驗 挑選成瘤大小較均一的裸鼠，分為對照組(n=24,接種4-9細(xì)胞，MUC1穩(wěn)定沉默)和實(shí)驗組(n=24，接種c-7細(xì)胞，MUC1過表達(dá))；對照組和實(shí)驗組均再分為3個處理組(每個處理組各8只)，分別給予0.9％氯化鈉液(空載)、順鉑、紫杉醇處理。接種食管癌細(xì)胞后第10天起每只裸鼠經(jīng)腹腔注射給藥，順鉑按8 μg/kg的劑量于開始藥物試驗的第1天及第7天腹腔注射；紫杉醇按20 μg/kg的劑量于開始藥物試驗的第1天及第7天腹腔注射。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 腫瘤體積抑瘤率及體積曲線 于給藥后的第1天開始，每3 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長短徑，腫瘤的體積(V)按以下公式計算：V = A×B2/2(A，腫瘤長徑；B，腫瘤短徑)。給藥后的第26天處死裸鼠。腫瘤體積抑瘤率的計算∶抑瘤率=(對照組-實(shí)驗組)/對照組×100％；繪制腫瘤體積曲線。

1.5.2 化療藥物對體質(zhì)量的影響及體質(zhì)量曲線 于給藥后的第1天開始，每3 d用電子天平測量裸鼠體質(zhì)量，繪制體質(zhì)量曲線。

1.5.3 化療藥物對移植瘤增殖調(diào)控因子Ki-67及凋亡調(diào)控因子Bcl-2表達(dá)的影響 給藥后的第26天將裸鼠處死，取移植瘤組織，用10％多聚甲醛固定后進(jìn)行石蠟包埋、切片。采用免疫組化SP法檢測MUC1過表達(dá)的食管癌細(xì)胞形成的移植瘤經(jīng)化療藥物干預(yù)后Ki-67及Bcl-2的表達(dá)情況。顯微鏡下觀察、拍攝。

2 結(jié) 果

2.1 化療藥物對腫瘤體積的影響及體積曲線 在藥物試驗的第26天將裸鼠處死。根據(jù)時間點(diǎn)(腫瘤細(xì)胞種植后天數(shù))繪制MUC1過表達(dá)及穩(wěn)定沉默的食管癌細(xì)胞株在裸鼠成瘤的腫瘤體積曲線(見圖1A、1B)。4-9細(xì)胞注射成瘤的裸鼠中，與空載組相比，紫杉醇組及順鉑組均未見明顯的腫瘤體積抑制效應(yīng)。c-7細(xì)胞注射成瘤的裸鼠中，紫杉醇對腫瘤體積抑瘤率為23.1％，順鉑對腫瘤體積抑瘤率為32.8％。

MUC1過表達(dá)即c-7細(xì)胞注射成瘤的裸鼠中，給予不同化療藥物作用后，空載組和順鉑組在瘤細(xì)胞種植后的第20天腫瘤體積的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；空載組和紫杉醇組在瘤細(xì)胞種植后的第32天腫瘤體積的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而紫杉醇和順鉑組腫瘤體積的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。MUC1穩(wěn)定沉默即4-9細(xì)胞注射成瘤的裸鼠中，各組間腫瘤體積(兩兩比較)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

考慮到不同組別之間或各組別之內(nèi)體質(zhì)量差異對腫瘤體積的影響，將測得的腫瘤體積用對應(yīng)的裸鼠體質(zhì)量進(jìn)行校正后再進(jìn)行瘤體體積曲線分析，得到腫瘤體積/裸鼠體質(zhì)量曲線圖形(見圖1C、1D)，組間及組內(nèi)走勢和分析結(jié)果與未校正前基本一致。

2.2 化療藥物對體質(zhì)量的影響及體質(zhì)量曲線 給藥后的第26天將裸鼠處死。根據(jù)時間點(diǎn)(瘤細(xì)胞種植后天數(shù))繪制MUC1過表達(dá)及穩(wěn)定沉默的食管癌細(xì)胞株注射后的裸鼠體質(zhì)量曲線(見圖2)。在4-9細(xì)胞注射成瘤的裸鼠中，紫杉醇可以使裸鼠體質(zhì)量稍增加，紫杉醇組裸鼠在觀察時間中期體質(zhì)量較空載組減少，后期體質(zhì)量增加明顯。在c-7細(xì)胞注射成瘤的裸鼠中，紫杉醇及順鉑都可以使裸鼠體質(zhì)量減少，紫杉醇對裸鼠體質(zhì)量影響小于順鉑。

在c-7細(xì)胞注射成瘤的裸鼠中空載組和順鉑組第20～29天時的裸鼠體質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，紫杉醇組和順鉑組第20～29天時的裸鼠體質(zhì)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在4-9細(xì)胞注射成瘤的裸鼠中，僅紫杉醇組和順鉑組在第23～26天時的體質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 不同化療藥物對MUC1過表達(dá)/穩(wěn)定沉默種植瘤體積及腫瘤體積/裸鼠體質(zhì)量比率的影響

圖2 不同化療藥物對MUC1過表達(dá)/穩(wěn)定沉默種植瘤裸鼠體質(zhì)量的影響

2.3 增殖調(diào)控因子Ki-67及凋亡調(diào)控因子Bcl-2的表達(dá)變化 見圖3～4。C-7細(xì)胞注射成瘤的裸鼠中，Ki-67組織染色顯示，與空載組[陽性染色面積占總面積(7.69±0.82)％]相比，紫杉醇組與順鉑組Ki-67呈下調(diào)趨勢[陽性染色面積占總面積分別為(3.45±0.97)％、(3.01±0.19)％]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Bcl-2組織染色顯示，與空載組[陽性染色面積占總面積(2.37±0.65)％]相比，紫杉醇組與順鉑組Bcl-2呈上調(diào)趨勢[陽性染色面積占總面積分別為(4.01±0.3)％、(4.41±0.49)％]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

A,空載組；B，紫杉醇組；C,順鉑組

A,空載組；B，紫杉醇組；C,順鉑組

3 討 論

研究[2]表明，MUC1的mRNA或蛋白表達(dá)升高或異常常提示腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，且與患者的預(yù)后相關(guān)。

順鉑為治療多種實(shí)體瘤的一線藥，是廣譜抗腫瘤藥物。Chou等[3]發(fā)現(xiàn)，順鉑可以誘導(dǎo)子宮頸癌細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制與下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Fas有關(guān)。研究[4]還發(fā)現(xiàn)，順鉑可以引起食管癌細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制與Bax表達(dá)上調(diào)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，順鉑對MUC1過表達(dá)的食管癌細(xì)胞的生長有一定程度的抑制效應(yīng)，并可促使腫瘤壞死，說明順鉑可作為MUC1過表達(dá)的食管癌的治療藥物，但順鉑對裸鼠體質(zhì)量的影響較大。

紫杉醇是新型抗微管藥物，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制目前尚不完全清楚，抗凋亡蛋白bcl-2的磷酸化可能起關(guān)鍵作用[5]；也有研究[6]提示，紫杉醇通過非依賴p53途徑上調(diào)P21的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡；故紫杉醇誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本研究顯示，紫杉醇對MUC1過表達(dá)的食管癌細(xì)胞的生長有一定程度的抑制效應(yīng)，并可促進(jìn)腫瘤壞死，故可作為MUC1過表達(dá)的食管癌的治療藥物；紫杉醇與順鉑對MUC1過表達(dá)的食管癌的生長抑制效果無明顯差異，但紫杉醇對裸鼠體質(zhì)量的影響小于順鉑。

本研究確認(rèn)，免疫組化結(jié)果與腫瘤體積測量結(jié)果一致。免疫組化染色顯示，MUC1過表達(dá)的食管癌裸鼠形成的腫瘤經(jīng)順鉑或紫杉醇處理后，腫瘤增殖調(diào)控因子Ki-67呈下調(diào)趨勢，提示這兩種藥物可以通過下調(diào)Ki-67而影響腫瘤細(xì)胞增殖，由此抑制腫瘤生長。

綜上所述，紫杉醇和順鉑對MUC1過表達(dá)的食管癌細(xì)胞生長的抑制效果無明顯差異，兩者都可用于治療MUC1過表達(dá)的食管癌。

[1]王立順，朱迅.MUC1和MUC2 mRNA在不同腫瘤組織的表達(dá)及其意義[J].中國腫瘤臨床， 2000,27(4):258-261.

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[3]Chou TC.Theoretical basis,experimental design,and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies [J].Pharmacol Rev,2006,58(3): 621-681.

[4]蘇翔宇,李蘇宜,劉琳.奈達(dá)鉑聯(lián)合順鉑對人食管癌細(xì)胞株(Eca-109)抑制作用機(jī)制的研究[J].實(shí)用腫瘤雜志， 2010,25(2): 150-155.

[5]Pathann,Aime-sempe C,Kitadass,et al.Microtubule-targeting drugs induce bel-2 phosphorylation and association with pin1 [J].Neoplasia,2001,3(6):550-559.

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