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鐵羧葡胺磁化標記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的有效性及安全性研究

2014-09-07 06:09李冰玉沈運麗黃浙勇孫愛軍錢菊英鄒云增葛均波
中國臨床醫(yī)學 2014年2期
關(guān)鍵詞:磁化骨髓磁場

李冰玉 沈運麗 黃浙勇 孫愛軍 錢菊英 鄒云增 葛均波

(1.復旦大學附屬中山醫(yī)院a實驗室,b心內(nèi)科,上海 200032;2.同濟大學附屬東方醫(yī)院心內(nèi)科,上海 200120)

干細胞移植是治療全身退行性疾病、細胞壞死性疾病的新興方法。近年來,超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)標記干細胞的技術(shù)已經(jīng)被用于細胞磁共振活體示蹤和細胞磁靶向研究,成為探索細胞移植機制和改善療效的有力工具。目前,SPIONs研究大多采用Ferumoxides(商品名:Feridex)標記細胞,而關(guān)于鐵羧葡胺(SHU555A,商品名為Resovist)的研究較少。本實驗旨在探究Resovist標記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的有效性及安全性,為細胞磁靶向治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗試劑及儀器設備 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司,Resovist購自德國Schering公司,非特異性轉(zhuǎn)染劑多聚賴氨酸(PLL,分子量為275 kDa)、磷酸二胺(DAP)、亞鐵氰化鉀、中性紅、PKH26購自美國Sigma公司,淋巴細胞分離液購自加拿大Cedarlane公司,多聚甲醛、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自上海鈺森生物技術(shù)有限公司,CCK-8試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。水浴箱購自德國Hettich公司,倒置相差顯微鏡(型號:TS100)購自日本Nikon公司,透射電鏡(型號:CM120)購自荷蘭Philips公司,美國Thermo公司E.IRIS Duo ICP發(fā)射光譜儀,多功能酶標儀購自美國Bio-Rad公司,CASY分析儀購自德國Model TT公司,釹鐵硼圓柱體永磁鐵(直徑8 mm,中心表面磁感應強度為0.6 T)。

1.2 大鼠骨髓MSCs的分離培養(yǎng) 雄性SD大鼠,體質(zhì)量80 g,頸椎脫臼法處死,75%乙醇浸泡5~8 min。在超凈臺內(nèi),剪開大鼠腿部及上肢皮膚,分離腿部及上肢肌肉,取出股骨、脛骨和肱骨,于股骨、脛骨和肱骨1/2處剪斷,暴露骨髓腔,用低糖DMEM液緩慢沖出骨髓腔中的細胞,將細胞懸液移入離心管,1000 r/min離心5 min,棄上清液,將沉淀細胞用含6%~10%胎牛血清的低糖DMEM完全培養(yǎng)液混懸,接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。原代細胞培養(yǎng)24 h半量換液,培養(yǎng)48 h全量換液;棄未貼壁細胞,培養(yǎng)72 h再次全量換液,以后每48 h全量換液;待細胞匯合度至80%~90%,消化、計數(shù),按5×104/cm2的細胞密度接種和傳代培養(yǎng);2~3 d后細胞融合度達90%左右,反復傳代擴增[1-2]。取第3代細胞用作實驗。

1.3 細胞磁標記法 將SPIONs與PLL按100∶3比例用無血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋,制成終濃度為50∶1.5 μg /mL的SPIONs-PLL標記培養(yǎng)液,室溫下輕搖混合60 min,然后將其加入MSCs的培養(yǎng)板,于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h,完成磁化標記[1]。

1.4 細胞標記效率檢測 (1)普魯士藍染色:細胞沉淀經(jīng)PBS洗滌3次后,用4%多聚甲醛固定15 min,蒸餾水洗滌3次;Perl反應液[2%K3(CN)6+6%HCL]中作用30 min,蒸餾水洗滌3次;1%核固紅復染3 min,蒸餾水洗去多余的核固紅,顯微鏡下觀察;(2)電鏡檢查:用胰蛋白酶溶液消化SPIONs-PLL復合物標記的MSCs,離心,棄上清液,加入2.5%戊二醛溶液、1%鋨酸后固定30 min,用0.5%醋酸鈾染色過夜,脫水,包埋,40℃烤箱放置12 h,60℃聚合24 h。用超薄切片機進行超薄切片,切片厚度為100 nm,并以200目銅網(wǎng)支持組織,用醋酸鈾染液和硝酸鉛染液分別電子染色30 min,在透射電鏡下觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)并攝影;(3)細胞鐵濃度測定:取1×105個細胞,離心沉淀,于110℃干燥過夜,加入500 μL高氯酸-硝酸混合物,60℃消化3 h以上,應用原子吸收分光光度儀測定鐵離子濃度,每種條件下均測定3個樣品。

1.5 細胞增殖和活力試驗 將細胞分為4組:未暴露于磁場的未磁化標記MSCs(MSCs)、暴露于磁場的未磁化標記MSCs(Mag-MSCs)、未暴露于磁場的磁化標記MSCs(SPIONs-MSCs)和暴露于磁場的磁化標記MSCs(Mag-SPIONs-MSCs)。磁場暴露是指在75 cm2細胞培養(yǎng)瓶底部放置8 mm的釹鐵硼圓柱體永磁鐵24 h。增殖試驗中,細胞密度為3×105/瓶,每3 d換培養(yǎng)液,待細胞匯合度至90%時,消化并進行細胞計數(shù)[3]。細胞活力根據(jù)ECE方法應用CASY2 分析儀檢測[4]。所有試驗均重復3次。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠MSC的分離培養(yǎng) 大鼠骨髓液接種24 h時即有少量細胞貼壁生長,呈卵圓形及細小梭形;48~72 h后貼壁細胞伸展;3~4 d后出現(xiàn)較大的克隆,呈集落生長,為形態(tài)均一的梭形細胞;經(jīng)5~7 d細胞匯合度至80%~90%。傳代細胞生長旺盛時呈漩渦樣,排列有極性,平均每2~3 d即可傳代,見圖1。

A~E分別為大鼠骨髓MSCs原代培養(yǎng)24、48、72、96和120 h;F~H分別為第1、2、3代細胞

2.2 MSCs的標記效率 大鼠MSCs經(jīng)Resovist標記后,普魯士藍染色顯示細胞內(nèi)均可見大量著色(藍色)顆粒,標記率接近100%,見圖2A。電鏡檢查顯示,未標記的MSCs細胞胞質(zhì)內(nèi)未見致密顆粒囊泡,標記的MSCs細胞胞質(zhì)內(nèi)可見大小不一的含鐵致密顆粒囊泡,見圖2B。電鏡下觀察細胞微細結(jié)構(gòu)(細胞和亞細胞水平),未見氧化鐵的破壞和毒性作用。50∶1.5 μg/mL Resovist-PLL標記MSCs 24 h后,應用原子吸收分光光度法測定大鼠MSCs鐵含量,為(21.77±3.62)pg。

2.3 MSCs標記和外加磁場的細胞毒性 以MSCs的細胞增殖能力為1,Mag-MSCs、SPIONs-MSCs和Mag-SPIONs-MSCs的相對細胞增殖能力分別為1.07+0.05、1.07+0.08和1.05+0.04,組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。以MSCs的細胞活力為1,Mag-MSCs、SPIONs-MSCs和Mag-SPIONs-MSCs的細胞活力比分別為1.030+0.029、1.011+0.021和1.018+0.024,組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖3。結(jié)果提示,MSCs標記和外加磁場對細胞增殖能力、細胞活力均無明顯影響。

圖2 普魯士藍染色(A)和電鏡觀察(B)Resovist標記的大鼠MSCs

圖3 Resovist標記和外加磁場對細胞增殖能力(A)和細胞活力(B)的影響

3 討 論

近年來,SPIONs標記干細胞的技術(shù)發(fā)展迅速,最早主要被用于細胞磁共振顯像和活體示蹤的動物和臨床研究。由于SPIONs具有超順磁性,因此SPIONs標記的細胞具有磁響應性,本課題組前期研究[1]和國外研究[5]均發(fā)現(xiàn),磁場能促進SPIONs負荷細胞的定向運動。關(guān)于心肌梗死的細胞治療的研究顯示,磁靶向可顯著增加細胞的短期停留,減輕左室重塑,改善心功能[6-8]。因此,磁靶向引導下細胞治療有望成為促進移植細胞歸巢的新手段,具有潛在的應用前景。

目前SPIONs種類繁多,國內(nèi)外研究較多的為Feridex,而關(guān)于Resovist研究較少。Resovist(直徑62 nm)作為內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)的磁共振對比劑,在部分歐洲國家已被批準臨床應用,在我國已完成Ⅲ期臨床試驗(復旦大學附屬中山醫(yī)院等)。本研究以Resovist-PLL標記大鼠骨髓MSCs,發(fā)現(xiàn)終濃度為50∶1.5 μg/mL的Resovist-PLL作用24 h后能使細胞鐵含量達(23.77±2.06)pg/細胞,而對細胞活力和增殖能力無明顯影響,提示Resovist-PLL能高效標記大鼠骨髓MSCs,具有實驗和臨床應用潛力。Resovist具有生物可降解性,進入人體后能被細胞代謝,進入正常血漿鐵池代謝過程。研究[9-10]表明,臨床批準的SPIONs制劑對標記細胞的存活、代謝活性、增殖、凋亡、分化、活性氧形成等方面幾乎沒有不良影響。Arbab等[11]觀察不同包被、直徑和濃度的SPIONs(17~65 nm碳氧葡聚糖或150 nm葡聚糖包被,培養(yǎng)液鐵濃度0.01~1.0 mg/mL)、加用或不加用脂質(zhì)體時對人腫瘤細胞的標記效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大直徑SPIONs顆粒(65 nm)比小直徑(17 nm)SPIONs能顯著增加鐵攝取[(4.37±0.08)μg Fe/105細胞 比(2.14±0.06)μg Fe/105細胞]。本研究中所用的Resovist顆粒直徑60 nm,大于Feridex(直徑50 nm),更有利于細胞攝取。

氧化鐵顆粒因葡聚糖羧基而帶負電荷,與細胞相互排斥,難以有效標記非吞噬性的干細胞或其他哺乳細胞。PLL等轉(zhuǎn)染劑為帶正電荷(2~48 mV)的大分子物質(zhì),最早用于轉(zhuǎn)染DNA到細胞核,可通過靜電作用包裹氧化鐵顆粒,易于被細胞內(nèi)吞攝取,具有簡便、安全、高效、非特異等特點。由于游離狀態(tài)的PLL有細胞毒性,并與濃度正相關(guān),所以確定合適的Fe-PLL比例十分重要,一方面要保證形成穩(wěn)定的、有較高標記效率的復合物,另一方面要盡量減小游離PLL的細胞毒性。一般認為,F(xiàn)e和PLL的比例為100∶3時能兼顧高轉(zhuǎn)導效率和低毒性,因此本研究選擇100∶3的比例。

在細胞磁靶向研究中,外加磁場和細胞磁感應性是研究的關(guān)鍵要素。本研究在證實細胞磁化標記效率的基礎(chǔ)上,也探討了外加磁場對磁化細胞的影響。結(jié)果顯示,0.6 T釹鐵硼圓柱體永磁鐵暴露24 h對細胞的活力和增殖沒有明顯影響。由于目前磁導向細胞移植研究均采用永磁體,磁場強度與本研究采用的相近[12-13],因此,本研究結(jié)果對動物實驗研究有一定的指導價值。

[1]Huang Z,Pei N,Wang Y,et al.Deep magnetic capture of magnetically loaded cells for spatially targeted therapeutics[J].Biomaterials,2010,31(8):2130-2140.

[2]Xie X,Sun A,Zhu W,et al.Transplantation of mesenchymal stem cells preconditioned with hydrogen sulfide enhances repair of myocardial infarction in rats[J].Tohoku J Exp Med,2012,226(1):29-36.

[3]Schafer R,Bantleon R,Kehlbach R,et al.Functional investigations on human mesenchymal stem cells exposed to magnetic fields and labeled with clinically approved iron nanoparticles[J].BMC Cell Biol,2010,11:22.

[4]Lindl T,Lewandowski B,Schreyogg S,et al.An evaluation of the in vitro cytotoxicities of 50 chemicals by using an electrical current exclusion method versus the neutral red uptake and MTT assays[J].Altern Lab Anim,2005,33(6):591-601.

[5]Kim JA,Lee HJ,Kang HJ,et al.The targeting of endothelial progenitor cells to a specific location within a microfluidic channel using magnetic nanoparticles[J].Biomed Microdevices,2009,11(1):287-296.

[6]Cheng K,Li TS,Malliaras K,et al.Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction[J].Circ Res,2010,106(10):1570-1581.

[7]Chaudeurge A,Wilhelm C,Chen-Tournoux A,et al.Can magnetic targeting of magnetically labeled circulating cells optimize intramyocardial cell retention?[J].Cell Transplant,2012,21(4):679-691.

[8]Cheng K,Malliaras K,Li TS,et al.Magnetic enhancement of cell retention,engraftment,and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion[J].Cell Transplant,2012,21(6):1121-1135.

[9]Arbab AS,Yocum GT,Rad AM,et al.Labeling of cells with ferumoxides-protamine sulfate complexes does not inhibit function or differentiation capacity of hematopoietic or mesenchymal stem cells[J].NMR Biomed,2005,18(8):553-559.

[10]Sun R,Dittrich J,Le-Huu M,et al.Physical and biological characterization of superparamagnetic iron oxide- and ultrasmall superparamagnetic iron oxide-labeled cells: a comparison[J].Invest Radiol,2005,40(8):504-513.

[11]Arbab AS,Bashaw LA,Miller BR,et al.Characterization of biophysical and metabolic properties of cells labeled with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and transfection agent for cellular MR imaging[J].Radiology,2003,229(3):838-846.

[12]Fukushima S,Campbell NG,Coppen SR,et al.Quantitative assessment of initial retention of bone marrow mononuclear cells injected into the coronary arteries[J].J Heart Lung Transplant,2011,30(2):227-233.

[13]Doyle B,Kemp BJ,Chareonthaitawee P,et al.Dynamic tracking during intracoronary injection of 18F-FDG-labeled progenitor cell therapy for acute myocardial infarction[J].J Nucl Med,2007,48(10):1708-1714.

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