王金福，張永霞，顧劍新，王彤光，孫維平，曹彩琴

(上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院,上海 201600)

復(fù)方中藥體外抗豬衣原體活性研究

王金福，張永霞，顧劍新，王彤光，孫維平，曹彩琴

(上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院,上海 201600)

應(yīng)用微量Vero細(xì)胞培養(yǎng)法，檢測(cè)復(fù)方中藥的體外抗衣原體活性，為防治豬衣原體病提供依據(jù)。結(jié)果表明，復(fù)方中藥的MIC值是39.06 mg/mL，隨著中藥濃度升高，包涵體的體積縮小、數(shù)量減少，直至消失，對(duì)照組未見中藥對(duì)Vero細(xì)胞有毒性作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方中藥體外對(duì)豬衣原體有抗菌活性。

復(fù)方中藥；衣原體；抗菌活性

豬衣原體病是由鸚鵡熱衣原體感染引起的一種人、獸、禽類共患的接觸性傳染病。主要表現(xiàn)為母豬繁殖障礙，公豬睪丸炎，仔豬肺炎、腸炎及多發(fā)性關(guān)節(jié)炎等癥狀，持續(xù)潛伏傳染為豬衣原體病的主要流行病學(xué)特征[1]。不同年齡、不同品種的豬均易感染，一般以懷孕母豬和仔豬多發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大的損失[2]。人的醫(yī)學(xué)臨床研究上有報(bào)道部分清熱中藥方劑對(duì)衣原體有比較好的治療效果[3]，但在養(yǎng)豬業(yè)上是否具有抗衣原體活性仍不清楚。本試驗(yàn)用微量Vero細(xì)胞培養(yǎng)法，對(duì)由柴胡、黃連、魚腥草、大青葉、當(dāng)歸等中藥組成的復(fù)方制劑在體外抗豬衣原體的活性研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)用中藥 柴胡、黃連、魚腥草、大青葉、當(dāng)歸等中藥原料均購(gòu)自上海余天成醫(yī)藥有限公司，按常規(guī)水提法進(jìn)行中藥有效成分的提取，即先用蒸餾水按10∶1的比例浸泡1 h，大火燒開煮沸后換文火維持30 min，收集濾液，向殘?jiān)性偌诱麴s水煮沸30 min，過濾，將2次濾液合并。蒸發(fā)濃縮成1 g/mL 的水煎劑，調(diào)pH 7.2～7.4，2 500 rmp/min離心10 min，過濾，將濾液分裝成5 mL/瓶的規(guī)格，高壓滅菌消毒后放4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 豬衣原體菌株 豬衣原體菌株為從松江一家庭農(nóng)場(chǎng)的豬只中分離得到的，經(jīng)SPF雞胚中傳6代，Vero細(xì)胞傳3代，能在Vero細(xì)胞上形成穩(wěn)定的包涵體的菌株。

1.1.3 單層Vero細(xì)胞的制備 Vero細(xì)胞用1640培養(yǎng)液培養(yǎng)(含10%乳牛血清)培養(yǎng)，取200 μlVero細(xì)胞懸液滴入96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后備用。

1.2 方 法

1.2.1 衣原體接種 取生長(zhǎng)合格的Vero細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用pH7.2的Hanks液輕洗細(xì)胞2次，按原培養(yǎng)液的10%加入衣原體接種液，37 ℃吸附2 h后棄去，每孔加入100 μL含放線菌酮(2 μg/mL)的衣原體分離培養(yǎng)液待用[4]。

1.2.2 復(fù)方中藥制劑抗衣原體活性試驗(yàn) 試驗(yàn)共設(shè)計(jì)3組：第一組是不含中藥的衣原體陽(yáng)性對(duì)照組、第二組是不含衣原體中藥對(duì)照組、第三組是中藥與衣原體作用組，每組做8個(gè)重復(fù)。中藥組是將1 g/mL中藥用Hanks液倍比稀釋成系列濃度后，分別取100 μL加入到接種好的Vero細(xì)胞的微量培養(yǎng)板，于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)120 h后棄去培養(yǎng)液，用95%乙醇固5 min后，姬姆薩染色鏡檢觀察胞漿內(nèi)是否有包涵體形成。

1.2.3 結(jié)果判斷 染色后在光鏡下鏡檢，在無中藥陽(yáng)性對(duì)照組中每孔均能看到衣原體包涵體，不加衣原體中藥陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好的條件下，再看中藥組的試驗(yàn)結(jié)果。光鏡下未見到包涵體的最低濃度為該中藥的最小抑菌濃度( MIC)。

2 結(jié) 果

衣原體經(jīng)Vero細(xì)胞培養(yǎng)120 h后，抗衣原體活性檢測(cè)結(jié)果表明：中藥組具有抗衣原體作用，具體見表1。在光鏡下觀察到隨著中藥濃度升高，包涵體的體積縮小、數(shù)量減少，直至消失。而陽(yáng)性對(duì)照則每孔均有包涵體出現(xiàn)，試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)中藥制劑對(duì)Vero細(xì)胞的生長(zhǎng)有影響。

表1 復(fù)方中藥制劑體外抗衣原體活性(MIC)Table 1 Anti-chlamydial activity of compound Chinese medicine in vitro(MIC)

備注：“-”代表無包涵體，“+”代表有包涵體。

Notes：“-”means no inclusion;“+”means inclusion.

3 小 結(jié)

在動(dòng)物臨床上可用于治療豬衣原體病的藥物種類相對(duì)較少，加之耐藥性問題在動(dòng)物臨床日益嚴(yán)峻，導(dǎo)致抗菌藥物的使用受限[5]。選擇中藥制劑來治療豬衣原體病是一個(gè)方向，盡管中藥制劑在豬衣原體治療上尚不夠成熟，但通過體外抗豬衣原體活性實(shí)驗(yàn)，將為篩選有效中藥和研究其作用機(jī)理提供理論依據(jù)。

本研究表明，試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的中藥復(fù)方制劑具有體外抗豬衣原體活性，而且未發(fā)現(xiàn)對(duì)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)有影響，說明應(yīng)用Vero細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)復(fù)方中藥制劑的體外抗豬衣原體活性是可行的。這為獸醫(yī)臨床篩選具有抗豬衣原體活性的中藥制劑提供了一個(gè)有效的手段和途徑。

[1]邱昌慶,程淑敏,周繼章,等.規(guī)?；i場(chǎng)豬衣原體病的檢測(cè)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2000,26(3):23-24.

[2]白挨泉,馮國(guó)金.廣東部分地區(qū)豬衣原體病的血清學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2004,31(12):37-39.

[3]李建軍,涂裕英,佟 菊.泌尿生殖道沙眼衣原體清熱中藥的藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)性病艾滋病防治,2001,7(1):31-32.

[4]Hinton D G,Shipley A,Galvin J.W,et al.Chlamydiosis in workers at a duck farm and processing plant[J].Austrlian Veterinary Journal,1993,70 (5):174-176.

[5]Nagy B,Fekete P Z.Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in farm animals[J].Veterinary Research,1999,30 (223):259-284.

StudyonAnti-swineChlamydiaActivityofCompoundTraditionalChineseMedicineinVitro

WANG Jin-fu,ZHANG Yong-xia,GU Jian-xin,WANG Tong-guang,SUN Wei-ping,CAO Cai-qin

(ShanghaiVocationalCollegeofAgricultureandForestry,Shanghai201600,China)

Micro-scale Vero cell culture method was employed to detect the anti-Chlamydia activity of compound traditional Chinese medicine so as to hopefully provide prescription reference for veterinary clinic treatment.The results showed that the MIC value of compound Chinese medicine was 39.06 mg/mL.And as the concentration of Chinese medicine rose,the size and number of inclusion bodies reduced and decreased till it totally disappeared.In the control group,no toxic effect of traditional Chinese medicine on Vero cells was observed.According to the experiment results,compound traditional Chinese medicine had anti-swine Chlamydia activity in vitro.

compound traditional Chinese medicine; chlamydia; antibacterial activity

2013-10-17，

2013-12-03

上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研資助項(xiàng)目(091024)

王金福(1977-)，男，河南民權(quán)人，碩士，副教授，主要從事動(dòng)物臨床疾病的診療與教學(xué)工作。E-mail:wjf3027@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)08-0070-02